哈希分光光度计采用基座和比色皿上样双检测模式,是一款高再现性的全波长分光光度计。适用于更宽浓度范围的样品检测,操作简便,不仅可用于测量DNA,RNA纯度、浓度,测量蛋白质浓度,也可用于一般物质分析中的吸光度检测。它可以在紫外可见光区任意选择不同波长的光,物质的吸收光谱就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量,相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
哈希分光光度计常用于定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的更高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。
影响哈希分光光度计读数不稳定的根本原因应该有两类:一类是能量降低,信噪比下降,这个可能性比较大;另一类是信号接收和处理故障。
1、能量降低
(1)比色皿
如果是在400nm以下波长测量,需使用石英比色皿,假如使用普通玻璃比色皿会吸收大部分的紫外能量。还有比色皿一般有光面和毛面之分,毛面是手捏的,光面是对正光路的。
(2)样品架
检查样品架是否在正确的槽位上,光是否全部照在比色皿上。方法是把波长设定到550nm左右,这时是比较明亮的黄绿色光,在样品室内用个小纸片挡下就能看到光斑。这个方法也能检测可见区的光源是否正常,滤光盘及波长驱动是否正常。
(3)空白样品
样品室不放任何东西对空气调零,看是否稳定。如果稳定的话,应该是空白样品本身吸光度太高了。方法是先对空气调零,然后把空白样品放入光路中看读数。如果读数很大,例如接近3A,则不可用。
(4)光源
先确认分析波长值,一般紫外可见有2个光源,紫外区用氘灯,可见区用钨灯,切换点一般在340nm。钨灯光较为明亮刺眼,氘灯光偏青紫色。如果仪器后面有透光窗口可以直接看,如果没有的话,需要打开外壳,打开灯室罩。光源都是用寿命的,能量变弱或干脆不亮了,要换灯。也有比较小的可能是光源供电电路故障,例如电源老化后可能导致无法正常点亮氘灯。
(5)光路
看光路是否偏了,可以把波长设定到550nm左右,观察样品室内有无黄绿色光线,光斑能否正确照在接收器窗口上。确认灯室内光源光斑是否正确照在单色器入狭缝上,确认光路中有无杂物挡住。确认单色器内反射镜、透镜、光栅、滤光片等是否发霉或积满灰尘,这个需要厂家才能处理。
(6)驱动电路故障
例如滤光盘驱动异常,导致滤光片用错或者干脆光路被遮挡。一般厂家或专业人员处理。
2、信号接收和处理故障
接收器(例如光电池或者光电倍增管)、放大电路、AD转换电路等都有可能。这类问题一般由厂家或专业人员处理,这里不详细说明了。