流程

类器官原代培养流程

准备工作

1、仪器设备

CO₂培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪刀、眼科镊。

2、试剂耗材

类器官原代

一、使用前准备

A.组织消化液准备

使用前将皮肤组织消化液Ⅰ从-20℃环境取出，放置室温使其融化，待溶解后上下颠倒瓶身数次，使液体充分混匀；

皮肤组织消化液Ⅰ加入12.5mL类器官原代培养缓冲液，配置后，在标签上记录配制日期，于2-8℃冰箱避光保存；

注：皮肤组织消化液Ⅰ配制完成后，建议在1个月内使用完。

B.配置含有5%FBS、1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液作为中和液用于终止消化；

 注：本实验所用离心管、枪头等，需提前使用PBS-BSA润洗液进行润洗。

二、原代组织消化

1、将手术样本环形包皮组织展平于10cm培养皿中，用含有1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液浸泡，反复漂洗，去除残留血液；

2、剔除组织的皮下结构，如脂肪、血管等，漂洗数次；

3、将组织均匀剪成0.5-1.5cm左右大小方块状，再次漂洗，直至漂洗液清澈；

4、将清洗后小块组织放入10mL新鲜配置的皮肤组织消化液Ⅰ中，表皮层朝下，置于4℃冰箱中过夜消化；

 注：建议消化时间为12-14h；

5、消化过夜后，用无菌镊子轻轻牵拉，将包皮组织的表皮和真皮分离，收集表皮皮片；

6、用无菌眼科剪将表皮剪碎成糊状，置入培养皿中；

7、加入3mL皮肤组织消化液Ⅱ，于37℃的培养箱中消化10min；

8、将培养皿置于显微镜下观察消化情况；

注：可轻拍皿壁，镜下见大量漂浮游离的细胞亮点，即证明消化过程完毕，否则可适当延长消化时间。

9、消化完成后，加入3mL含有5%FBS、1%青霉素-链霉素的类器官原代培养缓冲液终止消化；

10、反复轻柔吹打，使细胞团块分散；

11、40μm细胞筛网过滤，过滤液收集至50mL离心管中；

12、4℃，300 x g，离心5min；

13、使用类器官原代培养缓冲液重悬细胞沉淀；

14、4℃，300 x g，离心5min；

15、离心后弃去上清，保留底部细胞沉淀；

16、按照4-0.6x10^6/mL的密度，加入适量的基质胶并吹打混匀10-15次。

 注：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固；吹打时注意不要产生气泡；

17、按照50μL/孔的量，将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状；

注：种板时操作确保迅速，避免基质胶温度升高而凝固；

18、将培养板置于37℃恒温培养箱中20min，放置过程中避免晃动培养板；

19、取出培养板，每孔加入wan全培养基500μL；

20、显微镜下观察类器官种板情况，培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养。

类器官传代

一、使用前准备

A.类器官wan全培养基和传代消化液分装；

1、使用前按照每次用量分别分装wan全培养基和类器官消化液；

2、在配制好的wan全培养基和标签上记录配制日期，于2℃-8℃冰箱避光保存；

3、在配制好的消化液标签上记录配制日期，于-20℃冰箱避光保存；

注：建议wan全培养基在1-3个月内使用完；

B.基质胶

使用前将基质胶置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解冻；

注：使用过程中保持基质胶在4℃以下（建议置于冰上保存），温度升高会致基质胶凝固而不可使用。

C.润洗

类器官操作过程中，所有离心管、枪头操作前均需润洗，避免类器官贴壁丢失；

二、传代步骤

类器官培养6-7天或者类器官直径大于100μm，可进行传代培养，传代前从培养箱内取出24孔板，放置倒置显微镜下观察有无污染或异常。

1、取50mL类器官传代培养缓冲液放于冰上预冷；

2、取出培养板，在生物安全柜中沿孔边缘吸去旧培养基；

3、每孔加入500uL类器官传代培养缓冲液，反复吹打使基质胶从板底脱落，将类器官转移至15mL离心管，用预冷类器官传代培养缓冲液定容至10mL；

4、使用1000μL枪头温和吹打混匀20-30次，使类器官从基质胶中洗脱出来，4℃放置40min或-20℃冷冻3-5min；

5、4℃，400 x g，离心5min；

6、离心结束弃上清及上层基质胶，保留细胞沉淀；向管内加入新的预冷类器官传代培养缓冲液6mL，1000μL枪头温和吹打混匀20-30次；

7、4℃，400 x g，离心5min；

8、离心后弃去上清，保留细胞沉淀，向离心管中加入2mL类器官传代消化液，用1000μL枪头温和吹打混匀，室温消化3-7min（期间用吹打混匀1-2次），用预冷类器官传代培养缓冲液定容至6mL；

 注：消化并吹打结束后可取样镜下观察类器官消化情况，以类器官消化成单个细胞为宜；弃上清时操作要小心，避免吸液时类器官丢失；

9、4℃，400 x g，离心5min；

10、离心后弃去上清，保留底部细胞沉淀；

11、按照4-0.6x10^6/mL的密度，加入适量的基质胶并吹打混匀10-15次。

 注：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固；吹打时注意不要产生气泡；

12、按照50μL/孔的量，将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状；

注：种板时操作确保迅速，避免基质胶温度升高而凝固；

13、将培养板置于37℃恒温培养箱中20min，放置过程中避免晃动培养板；

14、取出培养板，每孔加入wan全培养基500μL；

15、显微镜下观察类器官种板情况，培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养。

类器官冻存

一、使用前准备

A.类器官冻存液和消化液分装

1、使用前按照每次用量分别分装冻存液和类器官消化液；

2、分别在配制好的冻存液和消化液标签上记录配制日期，于-20℃冰箱避光保存；

B.润洗

类器官操作过程中，所有离心管、枪头操作前均需润洗，避免类器官贴壁丢失。

二、冻存步骤

类器官培养6-7天或者类器官直径大于50μm，可进行类器官冻存，冻存前从培养箱内取出24孔板，放置倒置显微镜下观察有无污染异常。

1、取50mL类器官传代培养缓冲液放于冰上预冷；

2、取出培养板，在生物安全柜中沿孔边缘吸去旧培养基；

3、每孔加入500uL类器官传代培养缓冲液，反复吹打使基质胶从板底脱落，将类器官转移至15mL离心管，用预冷类器官传代培养缓冲液定容至10mL；

4、使用1000μL枪头温和吹打混匀20-30次，使类器官从基质胶中洗脱出来，4℃放置40min或-20℃冷冻3-5min；

5、4℃，400 x g，离心5min；

6、离心结束弃上清及上层基质胶，保留细胞沉淀；向管内加入新的预冷类器官传代培养缓冲液5mL，1000μL枪头温和吹打混匀20-30次；

7、4℃，400 x g，离心5min；

8、离心后弃去上清，保留细胞沉淀，向离心管中加入2mL类器官传代消化液，用1000μL枪头温和吹打混匀，室温消化3-7min（期间用吹打混匀1-2次），用预冷类器官传代培养缓冲液定容至6mL；

 注：消化并吹打结束后可取样镜下观察类器官消化情况，以类器官消化成单个细胞为宜；弃上清时操作要小心，避免吸液时类器官丢失；

9、4℃，400 x g，离心5min；

10、离心后弃去上清，保留底部细胞沉淀；

11、按照0.5x10^6cell/Vial（用户可根据需求决定冻存密度）向离心管中添加类器官冻存液；

12、充分混匀后，将悬液分装至细胞冻存管(1mL/Vial)；

13、放至程序性降温盒，并转移至-80℃冰箱，次日将类器官转移至液氮罐长期保存。

类器官复苏

一、使用前准备

A.wan全培养基分装

1、使用前按照每次用量分装wan全培养基；

2、在配制好的wan全培养基标签上记录配制日期，于2℃-8℃冰箱避光保存；

注：建议wan全培养基在1-3个月内使用完；

B.基质胶

使用前将基质胶置于冰上或2℃-8℃冰箱2-3h解冻；

注：使用过程中保持基质胶在4℃以下（建议置于冰上保存），温度升高会致基质胶凝固而不可使用。

C.润洗

类器官操作过程中，所有离心管、枪头操作前均需润洗，避免类器官贴壁丢失。

二、复苏步骤

复苏操作从冻存管解冻至放入培养箱培养过程控制在30min内，以确保足够的类器官存活。

1、准备低温、低速离心机一台，并将温度设定为4℃预冷；

2、加样枪头提前放置-20℃预冷，于加样前取出；24孔板提前放入37℃恒温培养箱预热；

3、基质胶提前放置冰上或4℃冰箱解冻；

4、15mL无菌离心管用PBS-BSA润洗液润洗后置于冰上预冷；

5、将wan全培养基从冰箱中取出，将温度平衡至室温；

6、将类器官从液氮存储管中取出，迅速将冻存管放入37℃水浴快速晃动1-2min，待冻存管内大部分冰块融化后取出；

注：从液氮罐取出类器官时，请严格按照实验室生物安全管理规定，做好防冻伤防护措施；

7、将冻存管放置于冰上，带入细胞间，用酒精棉球对管壁进行消毒后，在生物安全柜中将类器官悬液转移至预冷的15mL离心管内，加入5mL类器官传代培养缓冲液，使用润洗后的1000μL移液枪头轻轻吹打10次混匀；

8、4℃ ，300 x g 离心5min；离心后弃去上清保留沉淀；

注：离心后，仔细观察离心管底部，有一白色薄层沉淀，避免吸液时丢失类器官。

9、向离心管中加入600μL预冷的基质胶，轻轻混匀10-15次；

注：此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固；吹打时注意不要产生气泡；请根据细胞量适当调整密度；

10、按照50μL/孔的量，将基质胶与类器官悬液滴加至24孔板中心成半球形状；

注：种板时操作确保迅速，避免基质胶温度升高而凝固；

11、将培养板置于37℃恒温培养箱中孵育40min，放置过程中避免晃动培养板；

12、孵育完成后取出培养板，每孔加入wan全培养基500μL；

13、显微镜下观察类器官复苏情况，培养板放入37℃细胞培养箱中继续培养；

14、类器官换液：每2天更换一次新鲜培养基。

注：接种后每日观察，整个操作应遵守无菌操作规程。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎一起交流哦！

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