在当今生物医学研究领域，多重荧光免疫组化(mIHC)技术正变得越来越重要。这项技术能够在单一组织切片上同时检测多种蛋白质，为我们提供了一个强大的工具，以揭示细胞和组织内部复杂的生物学信息。随着多重荧光免疫组化技术的不断发展，越来越多老师希望在自己的片子上看到更丰富的靶标信息，意味着我们需要用到更多种荧光染料去完成染色，但由于荧光染料产生的信号不是单纯的线性，而是呈现山峰状的分布，在最高点信号固然最好，但在最高点左右的一段范围内都能够捕获到它的信号，那么相邻的染料之间，难免会有信号的重叠，导致最后的结果无法被准确判读。那么如何来解决这个问题呢？

首先，我们需要选择合适的染料，明辨激发光和发射光，且不会导致荧光背景增强，选择相距波长较远的荧光染料是避免信号重叠的关键。例如，Absin提供的多色试剂盒中，四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI）的染料组合，这些染料之间几乎不会有串扰的情况。

其次，染色顺序的优化至关重要。我们建议从zui低丰度靶点（搭配亮度zui强的荧光染料）开始顺序染色，以最高丰度靶点（搭配亮度弱的染料）结束。此外，通过增加一抗浓度、降低荧光浓度或改变抗体的染色顺序，都可平衡各靶点染料的搭配。

染料搭配一般遵循“寡靶配强光，众靶配弱光”的原则，意思是表达比较弱的指标搭配荧光信号比较强的染料，表达相对强的指 标搭配信号比较弱的染料，Absin的TSA染料波长越短荧光强度越强，比如说需要染PD-1，CD8和CD3，我们手里有一个四色试剂盒（TSA520/TSA570/TSA650），通过IHC发现样本中PD-1的信号很少，CD3信号非常多，其次是CD8，于是选择TSA520搭配PD-1， TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比较合理。

接下来就是怎么安排染色先后顺序：

1）划分细胞定位，先外后内：确定每个指标的细胞定位，膜表达先染，胞浆或者胞核的后染（如果是指标比较多的情况下，胞内指标排在比较后面，经过前期多轮洗脱，可以不做细胞通透；如果指标很少，染胞内指标之前还是需要打孔，多个胞内指标也只需要打一次孔）；

2）确定抗原修复方式，先酸后碱：碱修复比酸修复的力度会更强，个别抗体在用碱修复以后会染出来很多非特异性，所以如果是相同的细胞定位，就先染酸修复，再染碱修复的抗体；

3）根据IHC结果判别，先弱后强：组化结果显示指标比较少，比较弱的，排在前面染，理论上来说越靠前染的指标效果会越接近单标染色；

4) 根据抗原指标的类型判断：一抗种类（洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白 > 胞浆蛋白 > 胞核蛋白）；除非有些抗体如E-cadherin（钙粘附蛋白E）、EpCAM（上皮细胞粘附分子）、Tuj1（β-III微管蛋白）与抗原结合十分牢固或者洗脱有问题，可降低一抗浓度， 增加洗脱时间或将这些抗体放到TSA标记的最后一轮做在实验设计中，我们还需要考虑抗体的特异性和交叉反应性。使用经过高度验证的抗体，确保得到可靠的结果。通常而言，经过IHC-P验证的抗体，同样也能在mIHC中使用，但需要再进行实验步骤优化。

此外，我们爱必信的多色技术采用了酪胺信号放大(TSA)技术，这允许我们在一张组织切片上实现多个靶标蛋白的共染色，最多可同时标记数十种蛋白。TSA技术的一个关键优势在于可以使用同一物种的多种一抗，而无需担心会发生交互作用，这大大简化了多重检测设计过程。

染色顺利做完后怎么能少的了分析呢？目前市面上数据分析软件还是比较多的，像免费的您可以下载imageJ、Qupath，缺点就是用法都需要您自行摸索；我们公司安装的是HALO和StrataQuest两款软件。从功能、分析的精准度和可操作性来说，肯定是大大优于开源软件的，且有软件专业的技术支持团队能够答疑解惑。您可以根据您的实际情况选择合适的分析软件，如果您实在无从下手，也可以找Absin，我们可以提供数据分析的服务~

HALO分析（可以做单细胞层面和空间分析）；单细胞水平分析包括：单细胞总细胞计数（染核）；单（多）阳性细胞计数、百分比、平均强度；空间水平分析包括：计算任意两个细胞之间的平均距离、最近的细胞的邻近度或渗透分析，数据分析结果以EXCEL形式/直方图交付。

StrataQuest是我们TG的扫描仪平台自带的（基本所有的病理领域的分析需求都能满足，可以出组织流式散点图，直方图），如下是StrataQuest分析软件直出的散点图和直方图。

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