细胞是生命的基本单位，是生物学研究中非常有用的工具。细胞培养的过程就是人工模拟细胞体内生长环境，置于无菌、适宜温度及酸碱度的环境中，保证充足的营养使其不断生长繁殖，并维持其结构和功能。作为基础又常规的实验技能，自然颇受关注。后续会创建《常见细胞培养攻略》系列，会为大家介绍一些常见细胞的培养方案，包括但不限于T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、干细胞培养等。今天主要是细胞培养入门指南的相关内容，其他的内容大家可以持续关注追更。

1. 细胞类型

1) 原代细胞(primary cell)：是指从机体的组织经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

2) 细胞系(cell line)：原代细胞经初次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。

3) 细胞株(cell strain)：是通过选择法或克隆形成法从原代培养细胞中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

图1 动物细胞培养的步骤(General Procedure for Cell Culture)

2. 培养体系

1) 培养体系的选择：主要分为含血清的经典培养体系和无血清培养体系。简单、细胞种类、小规模选择含血清培养体系；长周期、强掌控、追求细胞质量可选择无血清培养体系。

表1 含血清和无血清培养体系的区别图（图片源于优宁维）

2) 血清的选择：分为胎牛血清、新生牛血清、小牛血清；其中胎牛血清的普适性较好。血清主要为细胞提供基本的营养；血清中的微量元素可参与细胞的解毒代谢；血清中的抗蛋白酶成分也可以起到中和保护细胞的作用。小伙伴们想要了解更多血清信息，可以查看《细胞培养常见问题之血清篇》。当然，具体细胞使用何种血清可以参考相关文献或者实验组的经验。

表2 不同血清的区别图（图片源于优宁维）

3) 基础培养基的选择：根据培养基的来源和组成成分，分为天然培养基（组织提取液）、合成培养基（经典液体培养基如1640、DMEM等）、无血清培养基（如Lonza的X-VIXO系列培养基）。目前合成培养基和无血清培养基使用居多。同样，具体细胞使用何种培养基也可以参考相关文献或者实验组的经验。

4) 抗生素：目前实验室会在细胞培养过程中添加双抗（青霉素-链霉素）或者三抗（青霉素-链霉素-两性霉素B）用来预防细胞污染，但是对于长期的细胞培养并不建议持续使用抗生素，以防细胞产生耐药性。

5) 培养基中酚红的选择：作为PH指示剂，酚红是培养基的“常客”。酚红为雌激素类似物，在进行激素诱导或培养雌激素敏感的细胞时应慎用，另外酚红可能对下游的流式检测分析带来一定的干扰。

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3. 细胞来源

1) 从有资质的公司直接进行购买：比如Absin可提供全面的原代细胞及优化后适配的培养基，试剂和方案；ATCC作为全球quan威的生物资源中心之一，提供原代细胞、细胞系、微生物、重组物质等。

2) 从生物体中提取制备：如血液样本、实体组织样本等。

3) 实验室现有的冻存细胞复苏获得：细胞复苏的步骤在基本操作里面，大家可以接着往下读。

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4. 细胞培养相关信息收集及物质

所谓信息收集是指我们要在开始细胞培养前充分全面了解我们的细胞，大家可以参考文献、ATCC的或者是实验室的经验，需要获得的信息包括不限于以下几个方面：

1) 细胞特性：细胞的形态、增殖速度、细胞周期、传代频率……

2) 生长方式：贴壁or悬浮

3) 培养体系：含血清or无血清

4) 温度：多数人和哺乳动物细胞系是36-37℃；昆虫细胞27℃

5) PH：多数哺乳动物细胞系是7.4，昆虫细胞系6.2

6) CO2：多数适合5-7%CO2

5. 细胞培养基本原则

1) 无菌意识：使用无菌设备、试剂和耗材；使用个人防护装备，避免污染；试剂如有需要可使用0.22μm的过滤器进行无菌过滤；每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染，实验进行前，超净台以紫外灯照射 30 分钟灭菌，以 70 % 乙醇擦拭无菌操作台面；实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % 乙醇 擦拭无菌操作台面。

2) 试剂分装：培养基、血清、胰酶等试剂要养成分装保存的习惯，不同的细胞即使适配的培养基配方相同也要另外配制分装并做好标记。

3) 及时保种：尤其是珍贵细胞，在细胞状态良好的时候要及时冻存保种，以备不时之需。

6. 基本操作

1) 显微镜观察：首先观察细胞培养液的颜色（如果培养基中含有酚红指示剂的话，当培养液颜色变为黄色就意味着营养物质耗尽），其次镜下观察细胞的生长状态。如果细胞的长势良好，且汇合度未达到传代的要求，可视培养液颜色决定时候换液；若细胞生长状态不好，汇合度低，需要酌情优化培养条件，排除污染情况；若细胞过于密集，则需进行传代操作。

细胞汇合是指细胞在培养皿中附着生长的过程。汇合度是指细胞覆盖培养皿的百分比，不同类型的细胞需要达到不同汇合度后才能进行传代。

图2 显微镜观察细胞流程（图片源于优宁维）

2) 细胞复苏

图3 PBMC细胞复苏流程图
（PBMC Thawing Protocol: How to Optimize Cell Recovery）

a) 37℃水浴加热需要使用的培养基；

b) 从液氮中取出要复苏的细胞，尽量减少其暴露在室温（15-25℃）的时间；

c) 在37℃水浴快速解冻细胞，将冻存管转移到生物安全柜中，用70%乙醇或异丙醇擦拭冻存管外部；

d) 将细胞悬浮液转移到50mL离心管中，加入1mL培养基润洗冻存管，培养基同样收集到50mL离心管中；

e) 向50mL离心管中补加15-20mL培养基，室温300xg离心10分钟；

f) 小心弃掉离心后的上清液，使用适量wan全培养基重悬细胞，分装到合适的培养皿/瓶中，显微镜下观察细胞密度和状态，放入CO2培养箱中培养。

3) 细胞传代

图4 细胞传代流程图
（Cell Plating, Media Change, and Culture Maintenance Protocol）

a) 显微镜下观察细胞状态、汇合度以及是否污染，判断是否进行传代处理；

b) 以25cm2培养瓶、贴壁细胞为例，弃掉培养基，使用无菌PBS洗涤细胞以去除抑制胰蛋白酶功能的血清；

c) 加入2ml胰酶，覆盖细胞层，放入37℃ CO2培培养箱中孵育2min，期间可拿出观察细胞消化脱落情况（注意：不同细胞使用的胰酶浓度及消化时间不同）；

d) 弃掉胰酶，加入2ml wan全培养基吹散细胞；

e) 显微镜下计数，调整细胞密度分装到培养瓶中，将细胞置于 37ºC, 5% CO2 的培养箱中培养。

4) 细胞冻存

图5 分步冻存法流程图

a) 在细胞密度达到107 cells/mL时可进行冻存，采用分步冷冻法；

b) 悬浮细胞500 g室温离心10 min收集细胞沉淀，贴壁细胞胰酶消化并终止后离心收集；

c) 弃上清，冻存液重悬细胞沉淀，1mL分装并做好标记；

d) 将冻存管放置-20℃ 1h；-80℃过夜；转移至液氮中进行长期保存。

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