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WB内参选择指南

时间:2024-10-17      阅读:211

1、什么是内参?

内参是Western Blot实验中用于标准化和校正实验误差的一类蛋白质。它们通常是在不同组织和细胞中表达相对恒定的蛋白质,由管家基因编码,常用作检测目的蛋白表达水平变化时的参照物。

 

2、内参在WB中的作用是什么?

校正实验误差:内参用于校正蛋白质定量和上样过程中的实验误差,以保证实验结果的准确性。由于不同的样品在蛋白质提取、定量、上样等步骤中可能存在操作误差,使用内参可以对这些误差进行校正。

半定量分析:通过比较内参和目标蛋白的信号强度,可以对实验结果进行半定量分析。如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量,然后将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,用此数值进行样品间的比较和分析。

作为空白对照:内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否wan全,以及整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

确保实验结果的可比性:在比较不同条件下或不同组织中目的蛋白表达量的相对多少时,内参提供了一个参照标准,确保了实验结果的可比性。

 

3、常见的WB内参有哪些?

β-Actin:β-肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白,分子量42KDa左右,广泛分布于各种组织中,表达量丰富且相对恒定。它通常用作总蛋白的内参,尤其是在非肌肉组织中。然而,需要注意的是,β-Actin在某些特定组织(如心肌)中的表达量可能较低,因此并非在所有情况下都适用。此外,不同的β-Actin亚型在不同组织中的分布也有所不同,选择抗体时需考虑这一点。

 

大鼠脑裂解物20μg 

 

人结肠癌组织

 

Hela细胞 

 

abs171598 Rabbit anti-β-Actin Monoclonal Antibody

 

GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶):36kD左右,GAPDH是一种广泛表达的蛋白,适用于多种细胞类型。然而,在某些条件下,如缺氧或糖尿病,GAPDH的表达可能会受到影响,因此需要根据实验条件谨慎选择。

 

1: HeLa whole cell lysate 20ug Lane

2: THP-1 whole cell lysate 20ug Lane

 3: MCF7 whole cell lysate 20ug Lane

4: NIH/3T3 whole cell lysate 20ug Lane

5: mouse spleen lysate 20ug Lane

 6: C6 whole cell lysate 20ug Lane

7: rat spleen lysate 20ug 

 

abs132004 Rabbit anti-GAPDH Polyclonal Antibody

 

β-Tubulin:55kDa左右,β-Tubulin是微管蛋白的一种,参与构成细胞骨架。由于其在细胞中的稳定表达,尤其用于检测细胞骨架蛋白时。β-Tubulin的表达在多种细胞类型中相对恒定,但同样需要考虑特定条件下的表达变化,如在凋亡细胞中。

 

Hela细胞全裂解物

 

大鼠肾组织

 

NIH3T3细胞

 

abs171597 Rabbit anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody

 

除了以上介绍的内参以外,还有α-Tubulin、Hsp90等等,每个内参的分子量及适用情况不一样,建议选择之前做好功课。

 

4、如何挑选合适的内参,需要考虑哪些因素?

目的蛋白分子量:内参蛋白的分子量应与目标蛋白的分子量相差至少5kDa以上,以确保在凝胶电泳和Western Blot中能够清晰地区分目标蛋白和内参的条带。

样本种属来源:不同种属的样本可能需要选择不同的内参蛋白。例如,哺乳动物的组织或细胞样本常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等,而植物样本可能选择plant actin、Rubisco等作为内参。

细胞定位:根据目标蛋白的亚细胞定位选择相应的内参。例如,如果是检测全细胞或细胞质蛋白,可以选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等;如果是核蛋白,则可能选择Lamin B、Histone H3等作为内参。

实验环境:内参的选择还需要考虑实际的实验环境和样品的前处理。在某些特殊条件下,一些内参蛋白的表达可能会发生变化,从而影响其作为内参的稳定性和可靠性。例如,在缺氧或糖尿病等条件下,GAPDH的表达可能会增加,因此可能不适合作为内参。

组织特异性:不同的组织可能需要选择不同的内参。例如,肌肉组织中可能需要选择特定的肌动蛋白亚型作为内参,而在非肌肉组织中则可能选择β-actin等。

 

5、内参抗体和目标抗体如何孵育?

顺序孵育:在检测完目标蛋白后,使用strip缓冲液洗掉膜上的抗体,然后重新进行内参蛋白的抗体温育和显色检测。这种方法需要在两次孵育过程中使用同一张膜。

双膜法:在蛋白转膜后,根据预染的蛋白质Marker的大小将膜剪成大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行孵育和显色。

同时孵育(如果分子量相差较大):如果目的蛋白的分子量与内参蛋白的分子量相差较大,可以在转膜后的同一张膜上同时进行两种抗体的孵育。由于条带位置的差异,可以在同一张膜上分别检测内参和目标蛋白。

使用标记内参抗体:有些实验室使用预先标记有酶(如HRP)的内参抗体,这样可以在二抗孵育时加入这种标记内参抗体,按照正常操作进行显色。

 

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