关于内参蛋白Actin，那些你不知道的事儿
时间：2024-10-22 阅读：308
Actin（肌动蛋白）是细胞骨架蛋白的重要组成蛋白之一，分子量为43kDa，在物种之间高度保守。根据Actin的功能和组织定位的不同，主要分为三类：α-肌动蛋白(α-actin)、β-肌动蛋白(β-actin)和γ-膜肌动蛋白(γ-smooth muscle actin)。
1）α-actin存在于肌肉组织中，包括平滑肌和心肌，参与了细胞的收缩和肌肉运动；
2）β-actin广泛存在于细胞各个部位，包括细胞质和细胞骨架，它参与了多种细胞活动，如细胞形态变化、细胞迁移和细胞分裂；
3）γ-smooth muscle actin主要表达于平滑肌细胞，参与平滑肌收缩和组织修复。
其中，β-actin常被用作内参蛋白，从而被大家所熟知，它可以作为实验中蛋白负载量和表达水平的标准参照物。在WB实验过程中，通过检测和对比目标蛋白与β-肌动蛋白的相对表达水平，可以对目标蛋白的表达进行定量和比较。然而，Actin的作用远远不止内参蛋白那么简单，根据Nature、Science、Cell等zhi名期刊上发布的相关研究结果表明，它在囊泡运动、细胞迁移、吞噬和细胞内运输等生物过程和疾病研究中都发挥着重要的功能作用。接下来，就和大家一起来聊聊关于Actin那些你不知道的事儿~
Actin相关抗体推荐：
货号 | 名称 | 规格 |
abs171598 | Rabbit anti-β-Actin Monoclonal Antibody | 100uL |
abs173774 | Mouse anti-α-Tubulin Monoclonal Antibody | 100uL |
abs172154 | Mouse anti-α Smooth Muscle Actin Recombinant Monoclonal Antibody(R142) | 100uL |
abs171819 | Rabbit anti-α smooth muscle Actin Recombinant Monoclonal Antibody(Cy5 Conjugate)(132-63) | 100uL |
abs171789 | Rabbit anti-alpha smooth muscle Actin Recombinant Monoclonal Antibody(FITC Conjugate)(132-63) | 100uL |
More··· | ||
一、Actin的研究方案
1、肌动蛋白聚合物的检测
在生理条件下，球状肌动蛋白(G-actin)很容易聚合成丝状肌动蛋白(F-actin)，同时发生ATP水解（图1）。肌动蛋白在体外可以从两端聚合，由于聚合速度快慢的差异，导致肌动蛋白丝具有内在极性，我们通常将聚合速度快的一端称为正端或倒钩端，而聚合速度慢的那一端称为负端或jian端。
图1 肌动蛋白丝的双螺旋结构
肌动蛋白的聚合取决于肌动蛋白单体对细丝末端的亲和力，肌动蛋白单体存在一个临界浓度(CC)，当低于该浓度，肌动蛋白不会聚合；当单体浓度高于CC时，肌动蛋白将发生聚合，直到游离单体浓度等于CC。然而，当我们在体外研究肌动蛋白时，它的程度则取决于所使用的条件。举个例子，在4°C条件下，肌动蛋白在2mM Mg2+和50mM KCl溶液中的CC值为0.03mg/mL，当这些离子不存在时，CC值则会超过3.0mg/mL。因此，我们可以通过改变离子类型和浓度，来改变聚合物的数量。
通过检测肌动蛋白聚合物，可以评估不同化合物对肌动蛋白功能的影响，目前常用的检测方法有以下4种：
1）芘结合荧光法
较通用、较灵敏、最易于操作的检测方法，对照样本和测试样本与少量芘连接的肌动蛋白混合，然后用荧光计跟踪聚合情况。芘肌动蛋白单体与聚合物结合后，荧光信号增强高达20倍。肌动蛋白聚合分为三个阶段，就像微管组装一样，这三个阶段分别是成核、生长和稳态。聚合的程度可由稳定状态的荧光水平来表示，加入phalloidin（鬼笔环肽）可测量出上限，将CC降至0.01mg/mL以下。这种检测方法的准确率超过95%，并且在检测过程中不会干扰样品。
图2 通过芘肌动蛋白荧光测量肌动蛋白的聚合情况
2）DNase酶抑制法
DNase酶抑制法是基于G-actin与DNase 1之间高亲和力的相互作用，从而抑制DNase的活性。这种检测方法的大优势在于它能区分G-actin和F-actin，因此，它通常被用于选择性地测定细胞提取物中单体和丝状肌动蛋白的量。此外，DNase酶抑制法还可以用于研究从肌动蛋白丝生成G-actin的结合蛋白。
3）粘度检测法
根据需要检测的聚合物差异性，粘度检测法可以分为高剪切或低剪切测量。如果是想测量短(1µm)和中(3-5µm)肌动蛋白丝之间的微小差异，那么可以选择高剪切法；如果要确定长丝样本的差异，则需要使用低剪切法。虽然粘度检测法能很好地比较两个样品之间的细丝交联情况，但最大的缺点是需要仪器设备、剪切细丝不太准确，并且当在测量肌动蛋白组装的方法时会干扰反应。
4）Spin-down实验
Spin-down检测法的原理是利用沉降差异来分离F-actin和G-actin，由于检测时间有限，这种方法的主要用途是获得稳定状态下肌动蛋白聚合物的定量值。该方法可与芘结合荧光法或DNase酶抑制法联合使用，以定量测定反应时间过程中肌动蛋白聚合物的数量。由于这种方法对待测样品具有破坏性，因此只有在对样品进行了所有其他测量方法后才能使用。这种检测方法还存在另一个缺点，那就是小的肌动蛋白寡聚体不会沉淀，因此定量值可能会高于实际上清液中肌动蛋白单体的数量。
至于选择哪种方法来检测肌动蛋白聚合物，则取决于实验室可用的设备和所需的灵敏度，也为大家总结了这四种方法的对比，供大家参考选择：
检测方法 | 原理 | 优势 | 缺点 |
芘结合荧光法 | 基于聚合过程中芘结合肌动蛋白的增强荧光 | 通用性强；灵敏度高；易于操作 | 需要仪器(荧光光度计) |
DNase酶抑制法 | 基于G-actin与DNase 1之间高亲和力的相互作用 | 能够区分G-actin和F-actin | 结果重复性可能会有10-20%的差异 |
粘度检测法 | 通过剪切微丝来检测的聚合物差异性 | 能很好地比较两个样品之间的细丝交联情况 | 需要仪器设备；剪切细丝不太准确；有干扰反应 |
Spin-down实验 | 利用沉降差异来分离F-actin和G-actin | 可与其它方法联合使用；易于操作 | 对待测样品具有破坏性；定量值不够准确 |
表1 肌动蛋白聚合物的检测方法对比
2、肌动蛋白的染色
肌动蛋白另一个重要的研究方案，就是它在细胞或组织中的荧光成像，最常见荧光染料是鬼笔环肽偶联物(phalloidins)。鬼笔环肽，又称鬼笔鹅膏素，最初是从毒蘑菇鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)中分离到的一种七肽毒素，以ji高的亲和力和特异性结合F-actin，不会结合G-actin。鬼笔环肽对大小纤维的亲和力相近，在许多不同的动植物物种的肌肉和非肌肉细胞中，基本都按照一个肌动蛋白亚基与一个鬼笔环肽分子的化学计量比结合。鬼笔环肽的非特异性结合几乎可忽略，染色和未染色区域的差异极其明显。此外，还有上文提到的，鬼笔环肽使得肌动蛋白聚合CC值降至1μg/mL，可用作一种聚合增强剂，产生的复合物高度稳定（解离常数约3×10–8M），能够抑制细胞松弛素、碘化钾和温度上升引起的去聚合和去组装活性。
由于荧光标记的鬼笔环肽不具有细胞透性，因此多用于固定细胞的肌动蛋白染色。带正电或负电的荧光染料会通过非特异性的离子相互作用与其他蛋白质结合，导致产生更高的背景；Actin-stain系列的鬼笔环肽荧光探针是非离子型的，因此更有助于获得理想的低背景结果。
相关产品推荐：
货号 | 名称 | 规格 |
abs47048270 | 罗丹明标记鬼笔环肽(橙红) | 300T |
abs47048271 | 鬼笔环肽-Fluor 488标记 (绿色) | 300T |
abs47048272 | 鬼笔环肽-Fluor 555标记(橙红) | 300T |
abs47048273 | 鬼笔环肽-Fluor 594标记 (红色) | 300T |
abs47048274 | 鬼笔环肽-Fluor 633标记(远红) | 300T |
abs47048276 | 鬼笔环肽-Fluor 680标记(远红) | 300T |
3、肌动蛋白的翻译后修饰
目前，关于肌动蛋白的翻译后修饰(PTM)研究也越来越多，PTM是高度动态且通常可逆的过程，其中蛋白质的功能特性能够通过在其氨基酸残基上添加化学基团或另一种蛋白质而改变。肌动蛋白是PTMs的主要底物，它可以经历至少17个PTMs，包括ADP-ribosylation、arginylation、dimethylation、phosphorylation、oxidation、nitration、O-GlcNAcylation、ubiquitination、SUMOylation、acetylation、carbonylation、isaspartylation、transglutamination、malonylation、glutathionylation、nitrosylation、crosslinking/isopeptide bonding。在研究翻译修饰后的肌动蛋白时，常用到的就是生物素肌动蛋白，它是一种具有多种用途的衍生物，可与链霉亲和素结合使用，作为细胞中肌动蛋白动态的探针。生物素肌动蛋白还可用于体外检测，标记肌动蛋白或使用链霉亲和素磁珠从复杂的混合物中选择性地纯化肌动蛋白。
肌动蛋白的翻译后修饰研究相关产品推荐：
货号 | 名称 | 规格 |
abs9748 | Biotin Labeling for Avitag Protein Kit | 200ug |
abs956 | Peroxidase Streptavidink | 100uL |
abs7989 | 1um链霉亲和素磁珠 | 1mL |
二、Actin的最新研究进展
最新研究表明，衰老会导致肌动蛋白表达和动力学发生变化，从而引发多种与年龄相关的疾病，包括癌症、血管疾病和神经退行性疾病1。对酵母的研究发现，肌动蛋白细胞骨架对营养代谢甚至决定寿命都至关重要2。
研究表明，随着年龄的增长，卵母细胞的数量和质量都会下降，从35岁到更年期，生育能力会明显下降。能量代谢是导致卵母细胞质量下降的机制之一3，其中肌动蛋白对哺乳动物的繁殖至关重要，肌动蛋白动力学的变化会直接影响与年龄相关的生育能力和生殖结果。
1、肌动蛋白在减数分裂中的作用
哺乳动物的单倍体卵子由二倍体卵母细胞通过减数分裂发育而成，受精后，卵子进行第二次染色体分裂，分离姐妹染色单体，染色体和随后姐妹染色单体的分离取决于纺锤体的功能。纺锤体由微管组成，而微管由微管蛋白亚基构成。纺锤体微管负责染色体排列，以促进分裂。最近的研究表明，除微管蛋白外，纺锤体肌动蛋白对纺锤体的正常功能也至关重要4。纺锤体肌动蛋白有助于将微管捆绑成功能性k纤维，而纺锤体肌动蛋白缺失则会导致k纤维稳定性降低和染色体分离错误5。除了纺锤体的功能外，肌动蛋白的动力学对细胞分裂也至关重要，因为肌动蛋白会形成一个收缩环，将新形成的子细胞分开。减数分裂和受精之后，新形成的胚胎进行有丝分裂，细胞有丝分裂所需的纺锤体微管与减数分裂纺锤体微管的不同之处在于，它是从中心体上成核的。因此，肌动蛋白还参与了有丝分裂，而不仅仅局限于减数分裂，这凸显了肌动蛋白在胚胎发育过程中的重要性6。
2、与年龄相关非整倍体的肌动蛋白动力学
在分离之前，同源染色体通过黏连蛋白固定在一起，与此同时，姐妹染色单体在其中心粒上仍被黏连蛋白结合。在减数第一次分裂过程中，同源染色体之间的黏连蛋白被裂解，但姐妹染色单体之间的黏连蛋白受到保护。姐妹染色单体的过早分离会导致染色体分离错误，造成卵子中染色体数目不正确，从而产生非整倍体7。
在人类中，最常见的非整倍体导致的疾病是三体综合征，比如21-三体综合征（也叫唐氏综合征）和克氏综合征(47，XXY)。在高龄产妇中，非整倍体的发生率较高，造成这一现象的可能原因是衰老卵母细胞中黏连蛋白的耗竭8。然而，Dunkley和Mogessie认为，仅靠黏连蛋白的耗竭并不能wan全解释非整倍体迅速增加的原因，就在去年，他们的研究揭示了肌动蛋白能够有效降低与年龄相关的卵子非整倍体的发生9。结果表明，F-actin负责在衰老卵子的黏连蛋白耗竭后维持姐妹染色单体的结合，此外，破坏年轻卵子中的F-actin会导致与衰老卵子类似的染色体过早分离。为了证实这一作用，他们还发现稳定的F-actin可减少衰老卵子中染色体的过早分离，更重要的是，这些结果都有依赖于肌动蛋白的动力学。作者推测，F-actin可能抵消了纺锤体微管的拉力。
图3 破坏F-actin会加速幼卵中类似衰老的染色体过早分离(Dunkley et al. 2023)
3、衰老表观基因组和肌动蛋白动力学
表观遗传变化是指在不改变基因本身的情况下导致基因表达发生变化的修饰，这些改变包括甲基化、乙酰化、磷酸化和Sumo化，可在DNA、RNA和组蛋白上被发现10。DNA甲基化是衰老的一种生物标志物，能够确定组织在整个生命周期中的年龄11。
白藜芦醇(resveratrol)是一种存在于葡萄皮和红葡萄酒中的多酚，一直以来都被认为是抗衰老剂和对多种疾病有益的补充剂12。根据临床前的动物研究，白藜芦醇能够改善生殖衰老13-14。一些研究强调，人类的生育能力仍存在很多未知数15，并且白藜芦醇在生殖衰老中的作用机制仍不甚明了。
最近，白藜芦醇能改善雌性小鼠生殖能力的机制终于被证实了，它能逆转与衰老相关的基因表达变化，并减少衰老卵母细胞的整体甲基化16。在比较年轻小鼠、中年小鼠和老年小鼠的卵母细胞时，作者发现了许多差异表达的基因，主要是许多参与肌动蛋白动力学过程的基因表达下调。白藜芦醇逆转了衰老卵母细胞的这种效应，消除了肌动蛋白相关基因启动子区域的甲基化，并恢复了它们的表达。
综上所述，在卵子形成和胚胎发育过程中，肌动蛋白对正常的减数分裂和有丝分裂至关重要。此外，有迹象表明肌动蛋白直接参与染色质重塑17，这一点仍有待在生殖衰老的背景下进行探索。
参考文献：
[1] Lai WF, Wong WT. Roles of the actin cytoskeleton in aging and age-associated diseases. Ageing Res Rev. 2020;58:101021.
[2] Sing CN, Garcia EJ, Lipkin TG, Huckaba TM, Tsang CA, Coughlin AC, et al. Identification of a modulator of the actin cytoskeleton, mitochondria, nutrient metabolism and lifespan in yeast. Nat Commun. 2022;13(1):2706.
[3] Bao S, Yin T, Liu S. Ovarian aging: energy metabolism of oocytes. J Ovarian Res. 2024;17(1):118.
[4] Mogessie B, Scheffler K, Schuh M. Assembly and Positioning of the Oocyte Meiotic Spindle. Annu Rev Cell Dev Biol. 2018;34:381-403.
[5] Mogessie B, Schuh M. Actin protects mammalian eggs against chromosome segregation errors. Science. 2017;357(6353).
[6] Plessner M, Knerr J, Grosse R. Centrosomal Actin Assembly Is Required for Proper Mitotic Spindle Formation and Chromosome Congression. iScience. 2019;15:274-81.
[7] Nagaoka SI, Hassold TJ, Hunt PA. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 2012;13(7):493-504.
[8] Herbert M, Kalleas D, Cooney D, Lamb M, Lister L. Meiosis and maternal aging: insights from aneuploid oocytes and trisomy births. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(4):a017970.
[9] Dunkley S, Mogessie B. Actin limits egg aneuploidies associated with female reproductive aging. Sci Adv. 2023;9(3):eadc9161.
[10] Chen X, Xu H, Shu X, Song CX. Mapping epigenetic modifications by sequencing technologies. Cell Death Differ. 2023.
[11] Salameh Y, Bejaoui Y, El Hajj N. DNA Methylation Biomarkers in Aging and Age-Related Diseases. Front Genet. 2020;11:171.
[12] Berman AY, Motechin RA, Wiesenfeld MY, Holz MK. The therapeutic potential of resveratrol: a review of clinical trials. NPJ Precis Oncol. 2017;1.
[13] Liu M, Yin Y, Ye X, Zeng M, Zhao Q, Keefe DL, et al. Resveratrol protects against age-associated infertility in mice. Hum Reprod. 2013;28(3):707-17.
[14] Okamoto N, Sato Y, Kawagoe Y, Shimizu T, Kawamura K. Short-term resveratrol treatment restored the quality of oocytes in aging mice. Aging (Albany NY). 2022;14(14):5628-40.
[15] Ochiai A, Kuroda K. Preconception resveratrol intake against infertility: Friend or foe? Reprod Med Biol. 2020;19(2):107-13.
[16] Gou M, Li J, Yi L, Li H, Ye X, Wang H, et al. Reprogramming of ovarian aging epigenome by resveratrol. PNAS Nexus. 2023;2(2):pgac310.
[17] Klages-Mundt NL, Kumar A, Zhang Y, Kapoor P, Shen X. The Nature of Actin-Family Proteins in Chromatin-Modifying Complexes. Front Genet. 2018;9:398.
Absin产品线：
爆款产品：试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
特色产品：鸡胚提取物CEE、B27、N2、霍乱毒素B亚单位CTB、牛脑垂体提取物BPE、百日咳毒素PTX、重组人胰岛素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...