支原体染色检测试剂盒可用于在培养细胞中对支原体或其它原核生物进行原位染色检测。主要用于检测培养细胞中是否存在支原体污染。

培养细胞中的细菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光学显微镜下可见，但支原体污染在光学显微镜下不可见，必须通过特定的检测方法进行检测。

 

使用说明：
1、细胞样品的准备：
（1）对于贴壁细胞，在六孔板或其它多孔板内或盖玻片上培养细胞至 50%-80%满。细胞培养过满会导致很难判断是否存在支原体污染。
（2）对于悬浮细胞，离心沉淀细胞，取少量细胞做细胞涂片，空气中充分晾干。
2、用 PBS 按照 1:10 稀释 Hoechst 染色液(1 体积 Hoechst 染色液加入 9 体积 PBS)。稀释后的 Hoechst 染色液宜在 24h 内使用。
3、加适量固定液固定 10~20min。 对于六孔板的一个孔，加入 1mL 固定液。确保固定液充分覆盖样品，固定前切勿对细胞进 行洗涤。对于贴壁细胞，固定前需去除培养液。
4、去除固定液，空气中晾干。
5、加适量 10 倍稀释的 Hoechst 染色液室温染色 10~30min。 对于六孔板的一个孔，加入 1mL 染色液。确保染色液充分覆盖样品，染色时注意避光。可以用铝箔纸避光。
6、去除染色液，空气中晾干。
7、滴加试剂盒中提供的抗荧光淬灭封片液，封片后荧光显微镜下观察蓝色荧光。 荧光显微镜观察时需 400 倍或 1000 倍放大观察(需使用油镜)。 没有支原体污染或其它原核生物污染的细胞样品，仅观察到细胞核的蓝色荧光，线粒体 DNA 不会被染色。

有支原体污染的细胞样品可观察到细胞核周围微粒状或丝状蓝色荧光。 支原体污染严重的细胞可以观察到大量微粒状或丝状蓝色荧光。

有细菌、酵母或霉菌污染的情况虽然 Hoechst 染色也会呈阳性，但细菌、酵母或霉菌污染在 光学显微镜下可以观察到，而支原体观察不到，由此可以初步区分是支原体还是其它微生物。

如有必要进一步鉴定，可以通过把支原体接种培养和 RT-PCR 等方法进行进一步检测。

1、Hoechst 染色试剂对人体有害，请注意适当防护。
2、固定液含有冰乙酸，有刺激性气味，宜在通风橱内进行固定操作。
3、荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。
4、检测支原体前最好用不含抗生素的培养液培养 2~3 代，这样更容易检测出支原体，因为一些抗生素可以抑制支原体生长。

2~8℃避光保存，有效期12个月。