简介

大多数体外细胞培养工作是在二维 (2D) 模式下进行的，这样细胞可以在平面上生长。然而，在 2D 中培养细胞以筛选药物可提供体内发生情况的图像有限，因为它无法捕获来自细胞外基质 （ECM） 的信号如何影响细胞对不同化合物的反应。相反，肿瘤细胞和细胞球可以在微孔板中培养，并在三维 （3D） 基质中成像，以便在更接近模拟体内肿瘤微环境的模型中筛选药物。

在这里，我们将新型光交联 3D 细胞培养平台、Symphony® 仪器和 VersaGel® ECM 水凝胶与 ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦高内涵成像系统配对，以展示适用于高通量筛选的 3D 检测。VersaGel 是一种可光交联的 ECM 水凝胶，用于 3D 体外和离体测定。这种可调谐的 ECM 水凝胶可概括人体生理学并支持多种细胞类型。肿瘤细胞悬液或细胞球可包封在 VersaGel 中。一旦细胞模型建立，可添加化合物，随后进行细胞染色，随后对培养物进行成像。

为了进一步提高通量，MetaXpress® 高内涵图像采集和分析软件允许在仅观察到 1-4 个细胞球/孔的实验中使用 QuickID。使用 QuickID，可在低放大倍率下快速扫描整个板，然后仅在更高放大倍率和多个 z 平面下对包含细胞球的孔或视野进行重新成像。我们展示

经化疗药物处理的三种不同 VersaGel 硬度中不同肿瘤细胞系的优化细胞球生长的结果，以说明 Symphony 和 VersaGel 如何与 ImageXpress Micro Confocal 系统搭配使用是一个简单的工作流程，可为药物筛选提供强大的解决方案（图 1）。

图 1：Symphony 和 VersaGel 3D 培养系统随后使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统成像，是一种生理学相关的方法，适用于高通量药物筛选。

优势

使用 Symphony 和 VersaGel 3D 平台筛选 3D 细胞球中的药物

使用自动 QuickID 靶向成像将数据采集速度

图像生成量比标准采集少 20X

渲染 3D 对象或 2D 投影以进行分割

Materials

•       已证实的肿瘤细胞系 - U2OS, MCF-7, HCT-116

•       玻璃底，96 孔微孔板（Greiner）

•       EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 检测试剂盒（Molecular Devices，PN R8348）

•       EarlyTox 活细胞/死细胞检测（Molecular Devices，PN R8340）

•       VersaGel ECM 水凝胶 （Cypre， Inc.）

•       Symphony 仪器 （Cypre， Inc.）

•       ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像系统与 MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件 （Molecular Devices）

3D VersaGel 细胞球生长和成像方法 

Symphony 和 VersaGel 3D 培养平台使用一种简单的技术，其中液体 VersaGel 最初以 1：1 的体积比例与培养基中的细胞或细胞球混合。接下来，VersaGel/细胞球混合物被 Symphony 交联，使整个板暴露于低强度蓝光下 60 秒，以使孔内的凝胶聚合。然后可以使用 ImageXpress Micro Confocal 系统对细胞球进行成像。由于 VersaGel 是微孔的，细胞可以用小分子化合物或抗体处理，并在包封在基质中后染色并固定甲醛。基质保持附着在平板上，可在 4°C 下储存，而不影响固定后的结构。

使用 QuickID 靶向成像提高成像效率

QuickID 通过靶向 96 孔板中成像的细胞球简化成像。首先使用 2X 物镜在一个视野中捕获整个孔。识别目标对象，并使用其 X 和 Y 坐标自动获得多个 z 平面上三个波长的更高放大倍数的图像。该过程比高倍放大下的手动细胞球成像快 10X，产生的高分辨率图像需要存储的时间减少了 20X（图 2）。

图 2. QuickID 用于简化细胞球图像的采集。在低放大倍率下采集的用于在一个视野中查看整个孔的图像被用于识别对象，以便使用跨多个 z 平面的三个波长在更高的放大倍率下自动重新成像。

优化生长和染色条件

为了优化源自 MCF-7 乳腺癌细胞的细胞球的条件，首先在超低附着微孔板中培养单个细胞球，方法是在圆底 96 孔板中接种 1，500 个细胞/孔，并培养 3-5 天。然后将培养基中的细胞球与三种不同的 VersaGel 制剂以 1：1 的体积比组合，并将 50 uL/孔转移至玻璃底 96 孔微孔板。使用 Symphony 仪器使凝胶聚合，并且在用 Hoechst 和 Phalloidin-AlexaFluor 546 固定和染色之前，使囊封的细胞球再生长三天。MCF-7 细胞球的共聚焦图像显示，它们在坚硬的 VersaGel 中通常保持更紧凑，并且在软制剂中生长的球形更少（图 3）。

图 3. MCF-7 细胞球在三种 VersaGel 硬度下培养。 细胞球形状和大小略有不同，但选择标准凝胶硬度进行进一步实验。

使用 EarlyTox 检测试剂盒检测化合物对细胞球的影响

EarlyTox 活细胞/死细胞测定用于确定 U2OS 骨癌细胞球的活性。在 VersaGel 中交联活细胞、预形成的细胞球后，它们再生长两天，然后用化合物处理 48 小时。用通常用于 2D 细胞培养的两倍染料浓度对细胞球进行染色，并孵育两倍长的时间。使用 QuickID 识别细胞球，并测量活染（绿色）与死染（红色）相比的存在（图 4A）。结果（图 4B）确认使用 Symphony 和 VersaGel 平台与预成形细胞球兼容 EarlyToxLive/Dead 检测。

图 4. EarlyTox 活细胞/死细胞检测与 VersaGel 中的细胞球兼容。A） 用三种不同的化合物处理预形成的 U2OS 细胞球 48 小时。B） 存在活染（绿色）和死染（红色）时测得的毒性。肿瘤细胞球对每种药物化合物的反应与预期一致。

然后，我们使用 EarlyTox Caspase 3/7 检测与在标准 VersaGel 中培养的预成型 HCT-116 结肠癌细胞球，如前所述。用三种不同的化合物处理细胞球 48 小时，并使用 QuickID 识别和测定凋亡细胞核的存在（绿色）
（图 5）。分析结果显示对化合物的预期反应，证实了 EarlyToxCaspase 3/7 NucView 488 检测与 Symphony 和 VersaGel 平台的兼容性。

图 5. EarlyTox 凋亡检测与 VersaGel 兼容。 用三种不同的化合物处理预形成的 HCT-116 细胞球 48 小时，并通过凋亡核（绿色）的存在来测定细胞毒性。

2D 投影分析得出的结论与 3D 分析相同
MetaXpress 软件用于比较 2D 和 3D 分析之间 HCT-116 细胞球中的凋亡。将细胞球悬浮在 VersaGel 中，并采集多个 Z 平面以收集跨越细胞球深度的图像。所有图像都被保存以构建 3D 对象，并且还用于创建单个 2D 最佳对焦投影（图 6A）。

使用EarlyTox Caspase 3/7 NucView 488 检测法测定细胞凋亡，并将 2D 投影分析与 3D 对象分析进行比较。图形分析表明，使用 2D 和 3D 分析，依托泊苷处理可增加 HCT-116 细胞的凋亡（图 6B）。

图 6. 2D 和 3D 分析的比较。左图是针对凋亡标记（绿色）和细胞核（蓝色）染色的最佳聚焦图像的叠加图。中心图像是使用*家蓝分割的绿色凋亡细胞分析 2D 图像时产生的分割掩膜。右图是 3D 对象的分割掩膜，Hoechst 细胞核呈单色伪彩，NucView 488 阳性细胞呈绿色。B. NucView 488 强度的测定表明，经依托泊苷处理的细胞凋亡增加。3D 分析显示，使用 2D 投影分析时，经处理细胞中的细胞球体积减少并不明显。

结论

该平台用途广泛，是肿瘤肿瘤学研究的理想选择。单个或大体积预形成的细胞球可转移至 VersaGel 中，细胞也可直接在微孔板的 VersaGel 中培养。VersaGel 刚度可进行调整，以实现最佳细胞球培养。

QuickID 简化了该过程，因此图像的采集时间比标准成像少得多，生成的图像也少得多，从而减少了存储需求。此外，MetaXpress 软件还简化了 3D 细胞分析工作流程，能够覆盖细胞图像、构建 3D 对象并将图像折叠成单个 2D 投影进行分析，然后分割阳性细胞。

该实验表明，将 Symphony 和 Versagel 3D 检测与 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统配对是一种多功能、强大的解决方案，可将药物筛选提升到一个新的水平。