自噬是干预治疗的一个潜在领域

自噬是隔离和降解那些被识别为错误或者仅仅是不再被细胞需要的蛋白和细胞器的一个胞内分解代谢过程。自噬通过实施清除入侵微生物、错误折叠蛋白及退化的细胞器等“管家”功能来支持正常的细胞进程。自噬对于维持细胞稳态很关键。除了作为细胞物质周转机制，自噬还能通过调节能量消耗速率及物质再利用等过程来支持生命体应对饥饿等挑战。

自噬在癌症、传染性疾病、糖尿病、神经退行性疾病及其他疾病中发挥着有益或有害的作用。自噬在神经细胞研究方面令人特别感兴趣，因为它帮忙维持着蛋白结构使其能在很长的轴突距离上发挥作用。与其他组织细胞不同，神经元的胞质内容物并不会被有丝分裂常规稀释。在阿尔茨海默病、帕金森病及其他神经紊乱中发现自噬发生改变且细胞毒素积累。这些观察结果导致了关于自噬作为干预治疗潜在领域各种机制的思考。定量实验变量对这一过程的影响是研究的基本要素，可能导致开发针对自噬的安全有效的治疗方法。

益处

生成未标记的神经突起的准确分割

更深入的了解神经退行性疾病的机制

更精确地区分相似的亚细胞结构

在单个孔中测量多种生物学以生成丰富的数据

材料

CYTO-ID® 自噬试剂（恩佐生命科学）

荧光溶酶体染料

iCell® 人类诱导多能干细胞衍生神经元（细胞动力学国际）

大鼠PC-12细胞（ATCC, cat no. CRL-1721）

ImageXpress® 显微高内涵成像系统（美谷分子仪器）

MetaXpress® 高内涵图像获取及分析软件（美谷分子仪器）

通过荧光成像观察自噬

即使在异质细胞群中，也可以使用现成的试剂对自噬进行可视化和表征。

CYTO-ID自噬试剂选择性地对吞噬团、自噬体和自溶酶体的膜进行染色。它还被证明与自噬体蛋白LC3-II共定位。它具有 495/519 nm 的荧光激发/发射曲线，可与标准 FITC 滤光片组一起使用。借助溶酶体特异性荧光可视化，可以检测与溶酶体的破坏性自噬体融合（图1）。在下面的示例中，使用激发/发射波长为 647/668 nm 的荧光溶酶体染料来表征溶酶体活性。标准 Cy5 滤光片组可用于检测深红色溶酶体染料的发射。

图1. 当内部或外部信号促进吞噬团（球形双膜隔离结构）的形成时，自噬过程就开始了。微管相关蛋白1轻链3α（LC3）刺激吞噬团的伸长，其开始吞噬细胞质靶标。在由自噬相关（ATG）蛋白介导的过程中，吞噬细胞在靶标周围关闭，成为自噬体。然后，自噬体与溶酶体融合，使其内容物和自身膜被水解酶降解1。

能够同时分析表型变化

活细胞中自噬体的CYTO-ID Green染色和溶酶体染色水平提供了有关化合物刺激或抑制自噬途径的机制的信息。这是使用 ImageXpress 显微系统完成的，这是一种高内涵筛选系统，用于对固定或活细胞、组织和小生物体进行宽场荧光或明场成像（图 2）。

MetaXpress软件使用预配置的应用程序或定制模块分析图像，以表征表型变化并产生特定的输出。定制模块能够同时检测、测量和对多个染色小体（如细胞核、自噬体和溶酶体）进行面积求和。测量值随时间推移或对照实验条件（例如一系列药物化合物浓度）绘制。

图2. 使用自动成像简化定量工作流程。简单和自动化的工作流程适用于高通量筛选，即使对于从铺板到最终结果可能需要数天的实验，也只需要最少的手动操作时间。

自噬体数量增加提示细胞窘迫

iCell人诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经元和大鼠PC-12细胞用于证明在384孔微孔板的每个孔中测试多个细胞反应的效用。

人类神经元

神经元以5000个细胞/孔接种，并按照制造商的建议进行生长。5天后，用在维持培养基中制备的一系列稀释化合物处理细胞。化合物孵育24小时后，对溶酶体、细胞核和自噬体进行染色，并使用ImageXpress显微系统将腔室加热至37°C对活细胞进行成像。使用60× Plan Fluor或40× Plan Apo物镜从每孔2-4个位点获取图像（图3A）。使用MetaXpress软件完成图像分析，以量化暴露于一系列浓度的实验化合物的影响（图3B）。虽然示例图像出于说明目的以60倍放大倍数显示细胞，但图3-6中的图表中的数据来自相同的实验，但使用40倍放大倍数。较低的放大倍率可生成足够质量的图像来测量细胞内囊泡，同时提供在每个视野内捕获更多细胞的好处。

大鼠PC-12细胞

将PC-12细胞以2000个细胞/孔接种并培养过夜，然后用在培养基中制备的系列稀释化合物进行处理。24小时后，对溶酶体、细胞核和自噬体进行染色，并在37°C下对活细胞进行成像。 在40×放大倍率下从每孔2-4个位点获取图像。使用MetaXpress软件完成图像分析，以定量暴露于一定浓度范围内的实验化合物的影响（图4）。

溶酶体反应提示自噬途径中断

人类神经元

溶酶体的测定在与前面描述的相同的孔中进行，并具有相同的程序，但添加了溶酶体染料（图5）。

大鼠PC-12细胞

在PC-12细胞中进行相同的测定以测量多种毒性事件。测量几个参数以确定对细胞内溶酶体的影响（图6）。

图3. 定量暴露于实验化合物对人类神经元的影响。（A）暴露于三种不同浓度的三种不同化合物后人类神经元的代表性60倍放大图像。自噬体（绿色）以剂量依赖性方式对细胞治疗作出反应。（B）氯喹、鱼藤酮和维拉帕米对人神经元聚集自噬体区域的剂量反应作用。自噬体可能被化合物暴露抑制或刺激。

图4. 暴露于实验化合物对大鼠PC-12细胞的影响的量化。（A）暴露于三种不同浓度三种不同化合物后的大鼠PC-12细胞的代表性60倍放大图像。自噬体(绿色)可以清晰地可视化和测量。（B）氯喹、鱼藤酮和维拉帕米对大鼠PC-12细胞中自噬体总面积的剂量反应效应。自噬体可能受到化合物暴露的抑制或刺激。

图5. 人类神经元中溶酶体反应的量化。（A）暴露于三种不同浓度的三种不同化合物后iPSC衍生神经元的代表性图像。溶酶体（红色）可以可视化和测量以检测反应。（B）氯喹、鱼藤酮和维拉帕米对神经元中总溶酶体面积的剂量反应效应，这是自噬的第二种测量。溶酶体测量可以表明在两个囊泡融合的最后一步自噬体途径的破坏。

图6. 大鼠PC-12细胞中溶酶体反应的定量。（A）暴露于三种不同浓度的三种不同化合物后大鼠PC-12细胞的代表性图像。上述图像是使用60× PF物镜采集的。溶酶体以红色显示。定量细胞内溶酶体的减少或增加为化合物的毒性机制提供了线索。（B）氯喹、鱼藤酮和维拉帕米对大鼠PC-12细胞中聚集溶酶体区域的剂量反应效应，这是自噬的第二种测量。溶酶体可能受到化合物暴露的抑制或刺激。

图7. 使用自定义模块的神经元分割。（左）透射光（灰色）、Hoechst染色的细胞核（蓝色）和CYTO-ID染色的自噬体（绿色）的放大40倍放大图像的叠加。（右）分割掩码，其中细胞体和从透射光图像中识别为蓝绿色的副产物，健康细胞核被识别为黄色，凋亡细胞核被识别为粉红色，自噬体被宝蓝色识别。即使远离细胞体（如箭头所指），也可以对自噬体进行计数。

使用透射光图像生成准确的神经元分割

检测远离细胞体的神经突生长物中的自噬体可能具有挑战性。获得未染色细胞体的明场图像有助于分段具有长过程的细胞。为了仅精确量化与神经元相关的染色细胞器构建了一个定制模块。这确保了仅检测感兴趣的细胞对象，而不是染色的人工制品或碎片（图7）。

AcuityXpressTM分析软件创建了自定义模块分析生成的读数剂量反应曲线（图8）。维拉帕米和氯喹均观察到明显的自噬体形成剂量依赖性反应。图9列出了自噬体和溶酶体形成所观察到的化合物抑制或刺激自噬的EC50值。

图8. 维拉帕米和氯喹自噬体形成的剂量反应曲线。使用图7中定义的自定义模块分析图像，生成的测量值用于在AcuityXpress分析软件中绘制曲线。

图9. 被测化合物的EC50值。通过将剂量反应曲线拟合到非线性模型来计算抑制或刺激自噬的化合物的EC50值。不同的细胞类型对药物暴露表现出不同的敏感性并不意外。

结论

我们证明了评估特定神经元细胞培养物中相对于实验条件的自噬的能力。这为研究人员提供了检查实验化合物对神经元自噬的剂量反应影响或筛选可能影响自噬的化合物库的机会，从而筛选与神经退行性疾病相关的神经元生理机制。 

ImageXpress显微系统提供了一系列功能，包括宽场高分辨率明场和多波长荧光显微镜，能够捕获在384孔微孔板中培养的人和大鼠神经元细胞的图像。MetaXpress软件能够分析这些图像，并绘制实验条件与自噬发生之间的关系，通过测量的自噬体，溶酶体和其他可视化细胞成分的聚集面积进行量化。

参考文献

1. Mizushima, Yoshimori and Levine (2010) Methods in Mammalian Autophagy Research. Cell 140:313-326.

2. Jin H. Son, et. al. (2012) Neuronal autophagy and neurodegenerative diseases. Experimental and Molecular Medicine 44, 2:89-98.