简介

哺乳动物细胞产生机械力的能力 推动、拉动或挤压 是细胞单独和共同用作组织以执行重要生理功能的固有能力。为了更好地理解细胞力产生背后的机制，确定新的药物靶点或候选药物，并验证被认为影响力产生的现有候选药物，必须采用定量筛选方法对细胞力进行功能评估。

优势

使用带荧光标记微图案的 384 孔板筛选大型药物文库，以了解其对细胞收缩力的影响

在较长的实验时间内追踪每个细胞群中每个细胞的收缩力

使用高通量、全孔成像加速采集

由于功能性细胞输出驱动了这些疾病，因此测量收缩力生成本身，而不是钙流等非特异性分子替代物，对于最大限度地提高药物开发的成功至关重要。本研究报告了我们开发的称为 FLECS（荧光弹性收缩表面）的自动化单细胞功能收缩性测定法，用于评估细胞的张力收缩性和测试化合物调节细胞施加力的能力。从 6 名致命性
哮喘患者和 6 名非哮喘患者获得的原代人气道平滑肌 （HASM） 细胞在收缩张力、对激动剂缓激肽的反应以及最终支气管扩张剂福莫特罗方面进行了比较。
使用单块 FLECS 384 孔板评估所有 12 个细胞系的单细胞收缩力，并使用 ImageXpress Micro 4 高内涵成像系统进行成像，该系统能够在一张4倍放大的图像中捕获了384孔板的整个区域(图1)。ImageXpress Micro 4系统提供的一致的宽视场成像可以在很长的实验周期内以4分钟的间隔跟踪超过100,000个收缩的单细胞。

图 1：含有细胞结合荧光微图案的 FLECS 384 孔板的单孔。

（A） 使用 ImageXpress Micro 4 系统，可以 4X放大采集 384 孔板的整个单孔。（B） 嵌入弹性基底的荧光微图案（绿色）被单细胞（以红色染色的肌动蛋白，以蓝色染色的细胞核）粘附和挤压，导致相对于空孔微图案的规则和可量化的尺寸变化，与细胞产生的力的大小相对应。

Materials

•       FLECS 检测试剂盒

•       384 孔 FLECS 板（Forcyte Biotechnologies）

•       Hoechst 33342 细胞核染色剂 （ThermoFisher）

•       原代人气道平滑肌细胞（6 个健康供体和 6 个哮喘供体）- 由罗格斯大学罗格斯转化医学和科学研究所 Panettieri 实验室提供

•       化学品

•       醋酸缓激肽 （Millipore Sigma）

•       福莫特罗 （Millipore Sigma）

•       采用 MetaXpress 软件的 ImageXpress Micro 4 高内涵成像系统（Molecular Devices）

评估12种患者源性HASM细胞的功能收缩性 

FLECS 384 孔板的功能收缩性，这些板包含一系列荧光标记的细胞外基质 （ECM） 微图案，这些微图案具有共价嵌入软基膜中的特定形状和大小，并接种有待评估的细胞。该研究评估了源自12名患者的 12 株原代 HASM 细胞，其中 6 株为致命性哮喘，6 株为非哮喘，每对为年龄、性别和种族匹配。

将原代 HASM 细胞接种在 384 孔板中，并带有荧光标记的微图案。将细胞在 37°C 的无血清培养基中培养 24 小时。使细胞粘附在这些模型上，以便应用各种处理。然后，在 37°C 下用 Hoechst 33342 对细胞染色 15 分钟，以鉴定与微图案结合的单细胞。细胞收缩在下面的弹性膜上产生机械力，并在图案周围产生校准良好的位移。在 ImageXpress Micro 4 系统上使用 4X 物镜采集细胞结合微图案的基线图像（细胞核的 DAPI 和荧光标记的微图案的FITC）。然后，用激动剂（10 pM 缓激肽）处理细胞，每 4 分钟对微图案进行一次成像，持续 12 分钟（仅 FITC 通道）。然后，用支气管扩张剂（50 pM 福莫特罗）或溶媒对照处理细胞，并微图案每 4 分钟成像一次，持续 16 分钟（仅 FITC 通道）。然后，在 37°C 下孵育平板 10 分钟，然后获取最终图像。按照图 2 所示的程序测量了基底张力、对缓激肽的收缩反应、对支气管扩张剂福莫特罗的敏感性以及这些反应的动力学。

图 2. 将 12 个细胞系接种到 FLECS 384 孔板中的实验步骤示意图。

图 3. 用于处理收缩力数据的 Forcyte 算法。 算法 （i） 识别和测量图像集 1 中的所有微图案，（ii） 交叉引用图像集 2 中每个微图案的位置，以及 （iii） 确定是否存在 0、1 或 >2 个细胞核（即细胞）。将包含单个细胞核（即 1 个细胞）的微图案的平均中心至末端位移与包含 0 个细胞核（即未占用模式）的所有未位移模式的相应测量值的中位数进行比较，并将差异绘制为水平直方图。

识别与微图案结合的单细胞并计算位移

图像从 MetaXpress 软件导出，并使用 Forcyte 算法处理用于收缩力数据（图 3）。根据 Hoechst 染色法鉴定与微图案结合的单细胞。排除了多个细胞结合的模式。对于由单个单元绑定的每个模式，中心与每个终端之间的平均距离包括一个数据点。

疾病细胞与正常细胞的收缩力特征随时间推移而明显不同，对 ~31，000 个激动剂反应细胞（来自 12 个细胞系）中的每一种进行追踪，从而选择 16 分钟时收缩增加的细胞进行进一步分析（平均约 72% 的细胞）。我们追踪了所有选定细胞的收缩分布变化（图 4A），发现 BK 处理后分布显示出稳健的向上变化，这些变化在添加赋形剂后未减弱，但在福莫特罗处理后停止或逆转。

在药物治疗过程中追踪了每个细胞群的中位收缩力值（图 4B），并观察到，对于 6 对年龄、种族和性别匹配的伴或不伴致死性哮喘的患者中的 5 对，哮喘患者的细胞表现出更高的色调、更大的 BK 诱导收缩，或两者兼而有之。在这些病例中，有 4 例的差异具有统计学显著性（图 5）。

图 4. 从微图案图像中收集的收缩力数据。（A） 单细胞收缩率测定的群体水平直方图，在使用前收缩激动剂缓激肽以及后来的支气管扩张剂福莫特罗或溶媒对照（1 名患者）治疗后随时间变化。（B） 所有 12 名患者的群体范围内直方图得出的中位值。

图 5. 年龄、性别和种族匹配的供体细胞的成对比较。

结论

结论

FLECS 孔板产品和 ImageXpress Micro 4 系统提供了一种功能上筛选大型药物库的方法，以检测已知与疾病过程有关的对细胞收缩力的影响。使用 FLECS 孔板检测单细胞收缩力，其中大量精确形状的粘合剂和荧光微图案沉积在标准微孔板底部的弹性膜上，可快速评估原代细胞或细胞系的功能性力生成，这些细胞或细胞系粘附在这些微图案上，并通过力生成引起尺寸变化。ImageXpress Micro 4 系统可快速（<10 分钟/整块 384 孔板）采集整个孔（一个图像中的完整 384 孔面积），空间分辨率足以观察细胞收缩力的微小差异。快速、全孔成像使 FLECS 技术可用于高通量筛选应用以及研究细胞力生成的高分辨和多维实验。本研究是之前发表的一项更大研究的一部分1。

参考

1. Pushkarsky， I. 等人 用于高通量单细胞力细胞测定的弹性传感器表面。Nature Biomedical Engineering 2， 124-137 （2018）。