简介

开发更复杂的、生物相关的、预测性的基于细胞的化合物筛选分析是药物发现的主要挑战之一。人们对使用三维(3D)培养物进行检测开发和转录生物学越来越感兴趣。3D培养被认为具有密切概括人体组织方面的优势，包括结构，细胞组织，细胞-细胞和细胞-基质相互作用，以及更多生理相关的扩散特征。水凝胶被广泛用作人工细胞外基质，用于在三维环境中培养神经细胞。完全合成的水凝胶被预先浇铸在96孔板上，具有深度表面密度梯度，促进沉积在水凝胶表面的细胞在3D中的渗透(3DProSeedTM水凝胶)。该平台具有高度的易用性和高度的自动化兼容性。

人类诱导多能干细胞(iPSC)来源的神经元越来越多地用于生理细胞模型的开发;与原代细胞和动物模型相比，它们的人类起源、长期的培养活力和高容量的可用性使它们在神经科学应用方面相对于初代细胞和动物模型更具优势。

目的

本研究的重点是利用ipsc来源的神经元在水凝胶基质中发育，开发一种高通量3D神经突生长实验，其长期目标是建立兼容自动化的神经退行性和神经毒理学筛选3D模型。

方法

ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦高内涵成像系统

配有宽场和共聚焦(60μm 针孔)光路

MetaXpress® High-Content 高内涵图像采集和分析软件

实验开发

用于实验的细胞是CNS.4UTM (Ncardia)，这是一种iPSC来源的细胞混合物，由神经元(谷氨酸能、多巴胺能和GABA能)以及星形胶质细胞组成。

Ectica Technologies提供的3DProSeedTM 96孔板。该孔板含有预先浇铸的全合成聚乙二醇基水凝胶。水凝胶具有较深的表面密度梯度，促进神经突的三维浸润和三维网络的建立。该水凝胶平台使用简单，自动化兼容性高(Simona et al. 和 Zhang et al.)。

水凝胶3D神经网络的形成

CNS.4U细胞在3DProSeed水凝胶中培养14天。细胞在200 μL培养液中以40000个神经元/孔接种。接种密度可以改变。培养基组成为50:50的神经基础培养基+ DMEM/F12 +补充剂(Ncardia)

细胞首先沉淀在水凝胶表面，然后渗透到水凝胶内部。神经突在移植后约24小时开始形成，在培养过程中延长至14天。随着时间的推移，神经突网络的形成使用透射光和共聚焦成像进行监测。

染色

终点测量用4%的甲醛固定细胞，然后用0.01%的Triton X-100渗透，用针对TuJ-1神经元标记的荧光基团偶联抗体和Hoechst核染料进行染色。

参考文献

1. Simona B.R. et al., Biomater. Sci., 3:586-591, 2015.

2. Zhang N. & Milleret V., SLAS Discovery, accepted, 2017.

3. Sirenko et al., Assay and Drug Dev Technologies12(9-10):536-47

结果：3D培养物的表型分析

成像

采用高内涵成像和分析技术对神经网络进行评价。我们优化了细胞培养和染色，并开发了共聚焦成像和分析方案，用于评估神经元在3D基质中的形态和活力。使用ImageXpress® Micro Confocal共聚焦高内涵成像系统(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)和10X或4X物镜，沿对焦轴(Z-stack)在不同平面上获取一系列图像。获得了11-33个平面堆栈，间距为5-10 μm，覆盖深度约为100-300 μm。保存所有单独的图像并用于3D分析，以及2D投影(最大投影或Best Focus)图像。

共聚焦图像，Z-stack, 30 μm 间距

图1. 将CNS.4U细胞接种于3DProSeed，在共聚焦模式下成像14天。细胞核用Hoechst染色(红色)以及TuJ -1微管蛋白染色(绿色)。四个平面代表凝胶中的不同焦平面。神经突网络延伸到水凝胶中几百微米。

图像分析

自动定量分析采用2种方法:投影图像分析(2D)或3D分析。使用神经突生长算法分析2D最大投影图像。表型读数包括通过多种读数来定量表征神经网络的范围和复杂性，包括测量神经突的生长，主干和分支的数量，以及细胞数量和活力。投影图像的分析速度更快，并且可以很好地定量。

图2. 将CNS.4U细胞以不同的播种密度(5000 - 80000个细胞/凝胶)接种在3DProSeed上。细胞培养14天，使用ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统成像。3D成像(Z-stacking)，并使用最大投影进行分析。分析允许自动测量细胞数量，神经突生长(神经突长度)，以及主干和分支的数量。上层平面表示透射光投影图像和用于神经元检测的叠加分析掩模。图表显示了各种测量结果与孔板神经元数量的相关性。三个复孔的平均值。

3D可视化和3D图像分析

分析软件允许组合来自不同平面的对象以及细胞和网络的3D可视化。自定义模块用于定义“纤维”的生长和细胞核。首先在每个平面中找到对象，然后使用“connect by best match”功能在3D空间中连接。3D分析通常需要更长的时间，但可以对体积中的物体(包括重叠的物体)进行更好的分辨和定量分析。

图3. 左图:MetaXpress软件对水凝胶中细胞和网络的3D可视化。3D可视化显示细胞核(假色)、TuJ-1阳性的神经突和细胞体(红色)。中图:在单个平面中定义的“纤维”的分析掩膜。通过3D分析确定每孔纤维(神经突)的数量、纤维(神经突)的总体积、分支点的数量和细胞(细胞核)的数量。图表显示了测量结果与孔板神经元数量(三次重复)的相关性。

3D水凝胶神经毒性实验

表型读数包括通过多种读数定量表征神经网络的范围和复杂性。我们评估了测定的可重复性，描述了多次测量，并测试了一系列已知的神经毒物化合物。比较了两种分析方法:使用标准神经突生长算法分析投影图像和使用定义纤维、分支和细胞核的自定义模块进行3D分析。

图4. 在接种后72h，将三种已知具有神经毒性作用的化合物以不同的浓度添加到神经元培养物中，浓度范围为0 ~ 10 μM。

上图:化合物对神经元发育的抑制作用。如上所述对细胞进行染色和成像。

上图:使用2D压缩图像(最大投影)进行分析。测定神经突生长、细胞数、主干和分支数。神经突生长的浓度-响应曲线显示:甲基汞(红色，IC50 5nM)，狄氏剂(蓝色，IC50 170nM)和鱼藤酮(绿色，IC50 220nM)。IC50值与3D分析相当(下图)，使用标准2D神经元细胞培养获得结果(Sirenko等)。

下图:3D分析结果。测量神经突(纤维)数量、纤维(神经突)体积、分支点和总细胞数。神经突总体积(μm3)的浓度响应曲线:甲基汞(红色，IC50 2nM)，狄氏剂(蓝色，IC50 170nM)，鱼藤酮(绿色，IC50 750nM)。

总结

利用3DProSeedTM水凝胶对iPSC来源的CNS.4UTM神经细胞进行3D培养和共聚焦高内涵成像，我们开发了一种定量高通量分析方法，可以评估3D神经元培养物的活力和形态变化。

更高的分辨率和多参数分析允许神经突和单细胞计数，并在3D中统计表征神经突的发育和分支。2D和3D分析能够表征神经网络，并提供定量测量，可用于定义IC50值并比较各种化合物的毒性。