简介

为了表现生物系统的复杂性，化合物筛选细胞模型已变得更加复杂。活细胞成像和三维模型可提供对活细胞结构和细胞过程的宝贵见解。最近，在开发代表肝脏1、胰腺2、神经元3和心脏组织4等不同类型人体组织的复杂类器官模型方面取得了巨大进展。心脏细胞球可在体外收缩，并对不同调节剂的作用作出反应。在此，我们描述了一种包括成像和分析方案的方法，该方法可用于体外监测和表征心脏细胞球的搏动模式。

在心脏毒性研究中，能够查看搏动心肌细胞的实时行为，使科学家能够通过使用透射光、相差和荧光成像从单次检测中收集多参数结果。在药物开发的早期阶段筛查化合物心脏毒性可大大降低因不良心血管影响而导致的晚期药物失败相关的成本。这已促成开发生物相关、高通量和高内涵筛选工具，如心肌细胞球。

高内涵筛选检测可产生大量数据，且需要快速和自动分析。SoftMax® Pro 导入功能允许您分析任何科学来源的数字数据，包括高内涵成像系统（图 1）。通过将基于图像的荧光强度数据导入 SoftMax Pro 软件，我们能够说明和量化一组心脏毒性化合物处理的心肌细胞球的跳动模式。

优势

分析基于图像实验的数字数据

使用 SoftMax Pro Peak Pro 分析算法快速定量心肌细胞的搏动模式

导入从任何科学仪器采集的原始数据，以便使用一个软件系统进行分析

材料和方法

将细胞球大鼠心肌微组织（瑞士 InSphero AG）在 96 孔 GravityTRAP （InSphero AG） 检测板中培养。在添加 DMSO、0.1 µM 异丙肾上腺素、0.1 µM 普萘洛尔、1 µM 维拉帕米、1 µM 西沙必利或 1 µM 利*卡因 30 分钟之前，用钙染料（EarlyTox 心脏毒性试剂盒，# R8210，Molecular Devices处理细胞球两小时。

使用 ImageXpress® Micro XLS 系统以 10 倍物镜每秒十次延时成像，共 300 个时间点。该系统是一种宽场自动化 （1x-100x） 显微镜，能够对固定或活细胞检测、组织和小生物进行荧光、透射光和相差成像。

使用 MetaXpress® 高内涵图像采集和分析软件对延时图像进行定量，以测量荧光强度 （FI）。动力学 FI 值被导出到 Microsoft Excel 中，排列到基于 Excel 的导入模板中，并导入到 SoftMax Pro v6.4.2 中。使用预先编写的心肌细胞跳动 i3（高级）方案分析数据，以自动计算十四个峰值属性：峰值计数、峰值频率、峰值振幅、平均峰值宽度和标准差、平均峰值上升时间和标准差、平均峰值衰减时间和标准差、平均峰值间隔和标准差、平均峰值底部宽度和标准差以及峰值规律性。

图 2. 心肌细胞球延时图像。 该图像序列显示对照大鼠心肌细胞球 （InSphero AG） 的一次搏动，这与细胞质钙的增加相对应，表现为钙敏感染料的荧光信号增加。

结果

在本研究中，使用一组心脏毒性化合物处理来自 InSphero 的搏动细胞球大鼠心肌微组织，并使用 EarlyTox 心脏毒性试剂盒进行检测，该试剂盒含有钙敏感染料，该染料经优化可测定与心肌细胞收缩相关的细胞质钙浓度变化。使用 ImageXpress Micro XLS 系统拍摄经处理的心肌细胞球的延时图像，以观察搏动行为（图 2）。通过基于 Excel 的导入功能模板将所得荧光强度振荡导入 SoftMax Pro v6.4.2，以定量峰值参数和化合物对心脏搏动的影响（图 3a）。与对照组相比，异丙肾上腺素处理的心肌细胞球的搏动频率增加，而普萘洛尔、西沙必利和利多*因处理的心肌细胞球的搏动频率降低。除了降低搏动频率外，西沙必利处理还破坏了心肌细胞球的搏动模式。用钙通道阻滞剂维拉帕米处理心肌细胞球可抑制钙信号（图 3b 和 4）。综上所述，结果与之前的研究一致5，6。

图 3. Peak Pro 分析算法。（A） Peak Pro 分析算法允许自动计算峰值参数，包括峰值频率、计数、振幅、宽度（在10% 和 50%的 高度）以及间距、上升时间、衰减时间和不规则间距。（B） 使用心肌细胞跳动 i3（高级）程序在 SoftMax Pro 软件中显示计算出的峰值属性，。

图 4. 心肌细胞球搏动模式。 在 SoftMax Pro 软件中，对照 （DMSO） 和处理过的心肌细胞球的搏动模式在 30 秒的时间段内以荧光强度图直观表示。顶部：对照（左）和维拉帕米（右）。中间： 普萘洛尔（左）和西沙必利（右）。底部：异丙肾上腺素（左）和利*卡因（右）。

结论

使用生物相关、基于细胞的模型进行高内涵和高通量心脏毒性筛选检测，从而在开发的早期阶段消除心脏毒性候选药物，可大大减少药物开发的时间和成本。为了保持高通量和高内涵筛选检测的效率，需要同样快速的数据分析。SoftMax Pro 导入功能可用于 SoftMax Pro v6.4.1 或更高版本，可实现从成像系统、实时 PCR 系统、非 Molecular Devices 读板机、闪烁计数器等各种科学仪器采集的微孔板格式数值数据分析。基于 Excel 和 XML 的两种导入选项可提供从手动导入到全自动数据导入和分析的一系列自动化功能。除了专门用于量化心肌细胞和心肌细胞球跳动等多峰振荡数据的 Peak Pro 软件算法和方案外，SoftMax Pro 的公式系统和语法助手还可帮助您获得所需的结果，包括 IC50 图和条件通过/失败结果。可保存自定义操作规程以供重复使用，无论数据源如何，均可确保高效且一致的分析。

参考文献

1.       Kermanizadeh A、Lohr M、Roursgaard M 等人 使用一种新型原代人 3D 肝脏微组织模型单次和多次暴露工程纳米材料后的肝脏毒理学。颗粒和纤维毒理学。2014; 11:56.

2.       Zuellig RA、Cavallari G、Gerber P、Tschopp O、Spinas GA、Moritz W 和 Lehmann

R. 改进了重力增强的大鼠和人胰腺假胰岛的生理特性。组织工程与再生医学杂志. 2014 doi： 10.1002/term.1891

3.       Kraus D、Boyle V、Leibig N、Stark GB 和 Penna V 神经细胞球 - 一种用于周围神经再生的新型 3D 体外模型。神经科学方法杂志。2015; 246:97-105.

4.       Zuppinger C、Agarkova I、Moritz W 和 Kelm J。心脏毒性检测的人 3D 心肌微组织模型。海报展示于：EUROTOX 2013。第 49 届欧洲毒理学协会大会。2013 年 9 月 1-4 日；瑞士茵特拉肯。

5.       Sirenko O、Cromwell EF、Crittenden C、Wignall JA、Wright FA 和 Rusyn I。人诱导多能干细胞中跳动参数的评估可实现体外心脏毒性定量筛选。毒理学和应用药理学。2013; 273(3):500-507.

6.       Sirenko O、Crittenden C、Calamaras N、Hesley J、Chen YW、Funes C、Rusyn I、Anson B 和 Cromwell EF。使用 iPSC 细胞对化合物对心肌细胞生理学的影响进行多参数体外评估。生物分子筛选杂志。2013; 18:39-53.