简介

神经突增生是体外研究神经元发育和神经元变性的常用检测。神经突的发展需要胞外和胞内信号的复杂相互作用。神经营养因子可以刺激或抑制神经突的生长。重要的是，神经元的发育会受到神经毒性化学物质的影响。

我们在 ImageXpress Pico 自动化细胞成像系统上评估了神经轴突生长检测，以测定化合物对发育中的神经系统产生不利影响的能力。选择该测定法是因为其作为神经系统发育中的关键过程，神经元在神经系统发育中扩展其神经突以形成完整的神经网络。总神经突增生通常是报告的最常见指标，而总分支和总过程等其他参数可能代表化合物可能抑制神经突增生的其他模式。

我们评估了化合物对神经突生长的特异性影响，包括通过多重测量定量表征神经网络的范围和复杂性。使用多次测量表征神经突生长的表型读数。神经突增生的特征是生长程度（每个细胞的总生长长度或平均生长）、神经突进程数（进程总数）和分支程度（每个细胞的总分支数和平均分支数）。

优势

• 评估化合物对神经突生长的特异性影响

• 通过多重测量定量表征神经网络的范围和复杂性

•  利用检测来研究体外神经元发育和神经元变性

Materials

• iPSC 源性神经元（人神经元试剂盒、NEURO KIT、XK-001-1V、XCell Science Company）

•  Poly-D-lysine 预包被 384 孔板（Corning Biocoat）

• 层粘连蛋白 （Sigma-Aldrich）

•  Hoechst （ThermoFisher Scientific）

•  Hank 的平衡盐溶液（Life Technologies）

• ImageXpress Pico 自动化细胞成像系统 （Molecular Devices）

• CellReporterXpress® 图像采集和分析软件（Molecular Devices）

方法

将 iPSC 源性神经元接种在经 3.3 mg/mL 层粘连蛋白处理的聚-D-赖氨酸预包被 384 孔板上。每孔接种一万个细胞，并在化合物处理前在 iCell Neuron 维护培养基中维持 48 小时。这些细胞中的神经突网络通常在接种后 2 小时开始形成，并且在培养中复杂性增加长达 10-12 天。按照制造商的建议，将神经元培养 14 天，然后在384 孔板中的 6 点浓度范围 （0.3-100 uM）。通过量化每孔的总生长、分支、过程和活细胞数量来评估对神经突生长的影响。使用 EC50值评估浓度-反应依赖性。

将细胞在 37°C 和 5% CO2 下暴露于化合物中72小时。接下来，取出培养基，用 4% 甲醛固定细胞，洗涤 2 次，然后用 1：100 的 AF-488 结合鬼笔环肽和 1 um Hoechst 33342 在无菌 Hank’s 平衡盐溶液中孵育 2 小时。Calcein AM 被用作神经突增生和细胞活性的标记物。孵育后，用含 0.1% 胎牛血清 （FBS） 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 代替染色溶液，以进行图像采集。

使用 10X 物镜，使用 ImageXpress Pico 系统采集单个孔的图像。通常，在 384 孔板中，每个孔捕获一个 10X 图像。10X物镜可提供足够的分辨率，以区分每张图像中相对大量的细胞 （>200） 中的神经突网络和亚细胞结构，约占孔总面积的 1/6。使用 CellReporterXpress 软件进行实时分析，该软件包含用于神经突追踪的分析模块。图 1 显示了来自 DMSO 处理的神经元的代表性放大图像，该神经元具有神经突追踪叠加。

图 1：使用 &-微管蛋白（绿色）染色和 CellReporterXpress 软件分析轨迹显示的对照和化合物处理细胞的神经元代表性图像。XCell 神经元用化合物处理三天，然后固定并用 AF488-conJugated anti-&-tubulin （TUJ-1） 抗体 （1：100） 染色。ImageXpress Pico 系统使用 10X Plan Fluor 物镜以及 FITC 和 DAPI 通道拍摄图像。使用神经突追踪分析方案处理图像。分析掩膜显示生长（绿色）、细胞体（蓝色）和分支点（粉色）。

结果

我们观察到化合物处理后神经突网络形成呈剂量依赖性抑制（图 2）。对这些实验中捕获的图像进行定量分析，包括推导多个参数，以便评估培养神经元的形态特征以及神经元网络的复杂性程度和程度。还定量了图像中总细胞体的数量，以估计化合物诱导的细胞毒性。由于整个实验中的细胞铺板和神经突生长非常一致且一致，因此我们使用每张图像的神经元总数进行统计分析。每个细胞生长的长度或每个细胞的过程或分支也被测量，但由于冗余，因此不用于统计分析。化合物的毒性效应可通过 EC5 值（50% 神经突生长抑制的化合物浓度）进行比较，该值源自神经突生长的 4 参数曲线拟合、分支数量、工艺或活细胞数量。图 2 显示了各种化合物（1 uM 浓度）中神经突网络总长度（总生长）的浓度依赖性曲线，以评估其潜在的神经毒性作用并优先考虑进一步的毒性评估。图 3 和 4 显示了在 10 uM 浓度下测试的神经毒性化合物。

图 2. 对于用 1 AM 指示化合物处理的神经元，测量神经突网络的破坏。EC50 值由总生长减少、罗登酮为 6 pM、甲基汞为 0.07 pM 来定义。定义分支点减少的 EC50 值，罗登酮为 3 pM，甲基汞为 0.07 pM

图 3. 在 10 pM 浓度下测试的神经毒性化合物的图像。

图 4. 在 10 pM 浓度下测试的神经毒性化合物的平均神经突生长。

结论

该检测可用于研究神经突增生的不同调节剂以及体外神经毒性效应。