简介

细胞迁移，广义上被定义为细胞从一个位置移动到另一个位置，在胚胎发育、创伤愈合等各种过程中发挥重要作用。它也是，癌细胞从原始位置扩散到身体不同部位转移的一个关键参数，参与包括肿瘤细胞侵袭、进入血管系统和远端定植等过程1。在体外，细胞会根据营养物质等化学信号发生迁移，这种化学吸引力可以用于研究细胞迁移机制。通过了解癌细胞迁移的机制，可以开发新的治疗方法来阻止癌症患者的癌细胞转移。

Corning FluoroBlokTM嵌套可以将细胞悬浮液与含化学引诱剂的底层溶液分离，使研究人员能够测定细胞迁移或侵染。利用黑色染料处理的荧光屏蔽聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜可以有效地阻止的400-700 nm光透射。荧光标记的细胞迁移通过膜中的8.0 um孔径达到化学引诱剂，利用酶标仪或成像系统通过底部读取可以很容易检测到细胞（图1）。在检测过程中迁移细胞仍能存活，可实现终点和时间过程的测定。

使用FluoroBlok 嵌套，从微孔板底部读取原始荧光可用于测定细胞迁移，但这种方法存在局限性。标准化RFU（相对荧光）测量需要细胞的标准曲线，荧光细胞标记、背景荧光和其他条件的变化可能会影响数据准确性。通过直接计数细胞，研究人员可以获得准确的细胞迁移数据。

在这篇应用文章中，我们展示了如何使用 SpectraMax i3x多功能微孔板读板机和 SpectraMax® MiniMax 300细胞成像系统结合FluoroBlok嵌套测量细胞迁移以及对细胞进行成像和计数。

优势

采集无损的高质量细胞图像

通过直接计数细胞获得准确的数据

使用SoftMax Pro软件快速识别细胞

图 1：FluoroBlok技术。荧光标记的细胞被接种在FluoroBlok嵌套中，通过8 um孔径迁移，从底部进行检测。

Materials

•       FluoroBlok HTS96孔多孔渗透支持系统，采用 8.0 um高密度PET膜（Corning cat. #351163）

•       SpectraMax i3x多功能微孔板读板机（Molecular Devices cat. #i3x）

•       SpectraMax MiniMax300细胞成像系统（Molecular Devices, cat. #5024062）

•       NIH3T3细胞（ATCC cat. #CRL-1658）

•       最小必需培养基（MEM,Corning cat. #10-010）

•       胎牛血清（FBS,Gemini Bio-Productscat. #100-106）

•       0.05%胰蛋白酶EDTA（Corning cat. #25-051-CI）

•       EarlyTox 活细胞检测试剂盒（Molecular Devices  cat. #R8342）

方法

使用10%FBS在MEM中培养NIH3T3细胞。将细胞进行胰蛋白酶处理并重悬于无血清培养基中，然后用EarlyTox活细胞检测
试剂盒中的4 µM 钙黄绿素AM染色。染色后，在FluoroBlokTM嵌套中每孔加入20k 个细胞。将含有FBS的培养基作为细胞迁移的化学引诱剂，无血清培养基作为阴性对照。血清培养基被用作
阴性对照。

表 1 采集和分析设置

在SoftMax Pro软件中创建自定义板设置，以适应FluoroBlok的尺寸。在设置中的板类型窗口中选择编辑孔板，并根据Corning提供的孔板信息修改尺寸。修改后的孔板设置被保存在新名称下。此自定义板设置参数可用于之后的FluoroBlok实验。MiniMax细胞成像系统可用于采集通过PET膜迁移的NIH3T3细胞的图像。使用表 1中列出的采集设置，在20小时内的多个时间点采集图像。读板机的内部温度被设置为37°C，以在读板过程中最大限度地保证细胞健康。

图 2. 目标物识别。 使用SoftMax Pro软件采集编辑器中的点单击（point and click）功能识别NIH3T3细胞。在图 A中，用户可以通过点击已知细胞（黄色标记）来设置荧光大小和强度。软件识别的对象标记为紫色 （B）。使用分类工具，用户可以区分细胞（红色掩膜）和较小的孔（蓝色掩膜）（C）。

图 3. 使用MiniMax细胞成像系统追踪细胞迁移。接种细胞后0小时（A和D）、接种后20小时（B和E）以及软件识别的对象（C和F）采集的图像。C和F中的红色掩膜表示分类为细胞的物体，蓝色掩膜表示分类为FluoroBlok膜孔的小物体。顶行显示含有化学引诱剂的孔，底行显示不含化学引诱剂的孔（阴性对照）

使用SoftMax Pro软件识别和定量迁移的NIH3T3细胞。在图像分析设置中选择离散目标物分析作为分析类型。根据细胞荧光强度和大小识别细胞，在软件中创建自定义设置（图 2）。通过点击4至6个代表性
细胞，可自动设置阈值，并由软件识别细胞。使用软件对迁移的细胞数量进行绘制。

结果

使用MiniMax细胞成像系统和SoftMax Pro软件，在荧光染色细胞通过 FluoroBlok 孔板迁移时对其进行检测（图 3）。虽然在不含化学引诱剂的孔中也有一些迁移，但在化学引诱剂存在的情况下，20小时后细胞迁移增加近3倍（图 4）。

图 4. 细胞迁移计数。 使用SoftMax Pro软件对NIH3T3细胞计数进行绘图。含有趋化剂的孔以红色显示，阴性对照孔以绿色显示。前两小时内两种条件处理的细胞均显示发生了迁移，但含有趋化剂的孔板中的细胞计数随着时间的推移持续增加。

结论

SpectraMax i3x多功能微孔板读板机和MiniMax细胞成像系统可与FluoroBlok细胞培养嵌套搭配使用，直接对高质量图像中的细胞进行计数，以测定细胞随时间的迁移情况。用户能够通过点击SoftMax Pro软件的用户界面快速设置细胞计数分析。与容易受细胞染色水平和背景荧光影响的原始荧光相比，图像分析可提供准确的数据。通过将SoftMax Pro软件的图像采集和分析功能与96孔FluoroBlok嵌套相结合，研究人员可以快速评估大量细胞迁移数据，以推进其在癌症和许多其他生物学领域的研究。

参考文献

1. Chambers, Ann F., Alan C. Groom, and Ian C. MacDonald. Metastasis: dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer Nature Reviews Cancer 2.8（2002 年）：563.