简介

为了更好地模拟体内微环境并且预测化合物的功效和毒性，细胞模型变得愈加复杂。人们对使用三维 （3D） 细胞球进行组织生物学建模和毒性评估越来越感兴趣。使用 3D 培养物开发通量更高的定量检测是一个活跃的研究领域。在本研究中，我们开发了用人诱导多能干细胞 （iPSC）形成 3D 细胞球的方法。使用高内涵成像 （HCI） 和快速动力学荧光成像 （FLIPR），我们用钙敏感染料监测细胞内钙水平的变化，测量了各种化合物对心脏细胞球搏动率和模式的影响。

心脏细胞球的形成

使用了来自 Cellular Dynamics International （CDI） 的冷冻保存的iCell心肌细胞进行此研究。将细胞解冻并铺板至超低吸附的（ULA） U 形底 96 孔板（20，000 个细胞/孔）和384 孔板（Corning）中（10，000 个细胞/孔），并在维持培养基中孵育 4 天以形成细胞球培养物。心脏细胞球在 48 小时内由 iPSC 源性心肌细胞有效形成，并在培养 3-4 天后自发收缩。然后，这些 3D 细胞模型可用 Ca2+ 敏感染料染色以评估心脏毒性。细胞内 Ca2+ 流引起的荧光强度变化被用作细胞球收缩的替代标记。在对心脏活性和心脏毒性化合物的刺激下，观察到基线搏动模式的显著改变。

我们在这里描述了两种记录、定量和表征 iPSC 源性心脏细胞球搏动模式的方法：使用高内涵成像（ImageXpress® Micro 高内涵成像系统）和快速动力学荧光成像（FLIPR Tetra® 高通量细胞筛选系统）。

优势

使用高内涵成像采集延时图像并分析心脏细胞球搏动模式

使用 FLIPR Tetra system 对所有孔中的钙流进行同步动力学
读取测量不同化合物对心脏细胞球活性的影响

图 1：检测工作流程示意图。将 iCell 心肌细胞2 解冻并铺板至 U 形底部低附着板中以形成 3D 心脏细胞球。培养 4 天后，用化合物处理细胞球所需的时长，用 FLIPR 钙 6 染料染色，并使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统采集延时图像。

使用高内涵成像随时间推移采集和分析心脏细胞球
成像方法可精确检测和可视化心脏细胞球，并包括在所需的时间周期和频率内采集延时图像。
本研究中使用的检测工作流程如图 1 所示。ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系统使用自动延时采集获得细胞球图像。记录了整个细胞球的钙流模式，发现其与收缩同步（图 2）。记录频率设置为 10-20 次读取/秒，每孔 5-10 秒（或更长）的读取时间，使用 FITC 激发和发射滤光片，放大倍数为 20 倍或 10 倍。将细胞保存在环境控制下（37 °C，5% CO2）或密封。为实现更高的读数频率，激发时间为 10 ms 或更短。该成像方法对任何细胞球尺寸都有效。我们测试了从每孔 3，000-20，000 个平板细胞制备的细胞球。我们证明，跳动频率不依赖于细胞球大小（数据未显示）。使用标准推荐操作规程，使用 Hoechst 细胞核染色和 FLIPR®钙 6 染料 （Molecular Devices， LLC） 对细胞进行染色。

图 2. 加载 Ca2+ 敏感染料的iPSC 源性心肌细胞球收缩的延时图像系列。 每个图像均以 100 毫秒的间隔拍摄。黄色/红色（伪彩）表示高 Ca2+ 浓度和收缩状态。

图 3. 化合物处理的心脏细胞球的动态荧光强度。将图像数据导入 SoftMaxPro 7 软件，用于分析跳动率、振幅、峰宽和其他读数。此处显示的是延时强度图的板视图。

使用 MetaXpress Journal（可应要求提供）分析图像。Journal会自动查找细胞球，确定每个时间点的平均荧光强度，并以板格式保存每个时间点的强度数据。通过保存细胞球图像的延时堆栈，视频剪辑可保存在成像软件中。通过在Display模式下显示强度与时间的关系，可以查看跳动模式。每次延时拍摄的强度数据也可以导出为 Excel 格式。可使用SoftMax Pro 7 软件（图 3）对跳动模式进行进一步分析，软件可导入强度数据、分析跳动模式并定义主要参数，包括通量、跳动振幅、峰宽或衰减时间的变化1，2。使用几种测试化合物观察到的
钙流频率的浓度依赖性曲线如图 4 所示。表 1 显示了使用钙流频率作为读数，计算的选定化合物的 IC 值。

图 4. 由选定化合物引起的搏动频率的剂量依赖性变化图。

表 1 根据钙流频率的浓度依赖性变化计算的选定化合物的 IC50 值。

使用高内涵成像评估细胞球活性
这种高内涵成像方法也可用于定义不同化合物对细胞活性的影响。例如，我们证明，在化合物处理后，可通过性染料组合染色来评估心脏细胞球的
细胞活力：钙黄素 AM（取决于酯酶活性的活细胞染色）、Ethidium 同型二聚体（细胞不可渗透的死细胞指示剂）和 Hoechst（标记所有细胞的细胞渗透性核染色，包括活细胞和死细胞群），可在即用型 EarlyTox 活细胞/死细胞检测试剂盒中获得。
用染料孵育两小时后，使用 ImageXpress Micro Confocal 系统对染色的细胞球进行成像。
使用 10x 或 20x 放大倍率拍摄 Z 层图像，间隔 10 μm，范围约为 150 μm。
使用 MetaXpress 软件使用 2D 和 3D 分析模块分析细胞球内总活细胞和死细胞的图像。先前描述了用于分析细胞球以检测活性标记物的方法3。图 5 显示了对照和地高辛处理的细胞球的示例分析。可使用以下测量值进行化合物效应的多参数
评估：细胞数量、细胞球大小和细胞活性。

图 5. 使用 iPSC 源性心脏细胞球进行心脏毒性成像。（上图）对照和地高辛处理的细胞球用活性标记物染色：Calcein A（绿色）、Hoechst（蓝色）和EthD-1（红色）。（下图）图像分析mask显示蓝色细胞球、粉色活细胞的细胞质和黄色死细胞。

使用 FLIPR Tetra 系统监测搏动心肌细胞球中的 钙流，从而优化高通量筛选

相比，FLIPR Tetra 系统与一次仅对一个孔进行延时成像的高内涵成像方法相比，FLIPR Tetra系统可以同时读取整块板的荧光强度，因此可以对所有孔进行钙流的同步动力学读取。该系统还可以兼容自动化液体和平板处理。
ScreenWorks Peak Pro 软件模块可用于分析和表征跳动曲线，从而产生跳动速率、峰值频率和宽度或不规律波形等多参数输出。

图 6. 对测试化合物的心脏细胞球反应进行快速动力学荧光分析。

（A）比较经选定化合物处理并使用 FLIPR Tetra 仪器测量的心脏细胞球的 钙流曲线。频率、振幅、峰宽和其他参数ScreenWorks PeakPro 软件模块自动计算。（B） 测试化合物对心脏细胞球搏动率影响的剂量-反应图。

iPSC 源性心脏细胞球的钙流检测，使用 FLIPR Tetra系统的 96 孔或 384 孔板中进行了高通量筛选 （HTS）优化。如前所述，在低附着 U 底板中形成心脏细胞球。我们观察到，如果细胞球尺寸相对较大（300-500 μm，由 10，000-20，000 个铺板细胞形成），FLIPR Tetra 系统可更有效地检测细胞球。使用 FLIPR 钙 6 染料监测与细胞搏动同步的 钙流的变化。将试剂（2X 浓度）添加到板中，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 2 小时。将细胞球暴露于化合物中 2 小时或 24 小时。使用 FLIPR Tetra系统以每秒约 8 帧的速度采集药物前读数，其中激发波长为 485 nm，发射波长为 530 nm。在不同化合物孵育时间后采集额外的读数，以了解不同化合物暴露时间之间的关系。钙流的记录通常持续约 2 分钟，以获得可靠的数据集。

为了说明 FLIPR Tetra 快速动力学荧光成像在测定3D 细胞模型方面的适用性，我们将心脏细胞球置于几种已知的心脏活性和心脏毒性化合物中，包括 α和 β-受体阻滞剂（异丙肾上腺素、普萘洛尔和维拉帕米）、已知影响 hERG 通道的化合物（卤吡多）和离子通道阻滞剂（利多卡因）。此外，还测试了几种环境毒素，包括杀虫剂（罗滕酮）、阻燃剂（磷酸三苯酯）和其他毒性化学物质。

治疗以剂量依赖性方式显著改变了跳动模式。对照和测试化合物处理的心脏细胞球的钙流（搏动）模式如图 6A 所示。毫不奇怪，化合物处理极大地改变了剂量依赖性分子的跳动模式（图 6B）。然而，将 3D 细胞球培养物测定的 IC50值与以传统 2D 形式铺板的细胞获得的细胞显示出测定灵敏度的显著差异，其中 3D 培养物在反应方面显示出一般的右移趋势（即 IC 值更高）（表 2）。与传统的 2D 培养形式相比，降低对这些测试化合物的心脏细胞球敏感性是否更具预测性，将需要额外的跟进。尽管如此，这些结果表明，将小型 iPSC 源性心脏 3D 细胞模型与快速动力学荧光成像相结合，以支持高通量心脏毒性筛选的潜在效用。

表 2. 根据两种不同形式的经测试化合物处理的 iPSC 源性心肌细胞计算的钙流 IC 值比较：3D 细胞球与传统 2D 培养。

参考文献

1.       Sirenko， O.， C. Crittenden， N. Callamaras， J. Hesley， Y.-W. Chen、C. Funes、I. Rusyn、B. Anson 和 E. F. Cromwell。“使用 IPSC 细胞对化合物对心肌细胞生理学的影响进行多参数体外评估。” 生物分子筛选杂志 18.1（2012 年）：39-53. 网络。

2.       Sirenko、Oksana、Evan F. Cromwell、Carole Crittenden、Jessica A. Wignall、Fred A. Wright 和 Ivan Rusyn。“评估人诱导多能干细胞中的搏动参数可实现体外心脏毒性定量筛选。” 毒理学和应用药理学 273.3（2013 年）：500-07. 网络。

3.       Sirenko、Oksana、Michael K. Hancock、Jayne Hesley、Dihui Hong、Avrum Cohen、Jason Gentry、Coby B. Carlson 和 David A. Mann。“使用共聚焦成像和三维图像分析对 IPSC 对肝脏细胞球的毒性化合物效应进行表型表征。” 检测和药物开发技术 14.7（2016 年）：381-94. 网络。