Elabscience®自主研发的 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit，可用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸 (PS) 有高度亲和力。当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料 FITC 标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可与双链 DNA 特异性结合并产生强烈的荧光，与 Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：

实验操作：

一步法

1．细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g 离心 5 min，弃上清，收集细胞，PBS 洗涤一次，轻轻重 悬细胞并计数。

2．取 1~5 × 105 重悬的细胞，300 ×g 离心5 min，弃上清。用 PBS 洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入500 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。

3．细胞悬液中加入5μL的Annexin V-FITC Reagent和5μL的PI Reagent (50μg/mL)。

4． 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 15~20 min。

5． 立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

注：流式细胞仪检测时Annexin V-FITC可用FITC通道，PI优先选择 PerCP/Cy5.5 通道，其次是ECD通道。

两步法

1．细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS 洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2．取1~5 × 10⁵重悬的细胞，300 ×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入100 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

3．细胞悬液中加入2.5 μL的Annexin V-FITC Reagent和2.5μL的PI Reagent (50μg/mL)。（由于两步法 分辨率更高，染色液用量减半依然可得到媲美一步法的效果；用户亦可根据自己的模型进行滴定后加入适量的染色液，用更少的量获得高质量的结果。）

4．轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。

5．加入400 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer，混匀样本。

6．立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。

注：流式细胞仪检测时Annexin V-FITC可用FITC通道，PI 优先选择 PerCP/Cy5.5 通道，其次是ECD通道。

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