B-27 无血清添加剂(50X) 是50X 浓度，使用前请用基础培养基(如Neurobasal™)稀释到 1X。如准备50 mL培养基：将1mL的B-27无血清添加剂(50X)加入到49mL的基础培养中。

一、培养基的配置

由于 L-谷氨酰胺在水溶液中不稳定，其分解产物对细胞具有毒性，神经元基础培养基和B-27中都未包含 L-谷氨酰胺，因此在配制培养基时须另外添加L-谷氨酰胺。

（1）置于4 ℃解冻本产品。

（2）在使用前无菌添加 2％本产品和0.5 M L-谷氨酰胺至神经元基础培养基，配制神经元培养基（注：下文中出现的“神经元培养基”即指此种添加B-27添加剂和L-谷氨酰胺的神经元基础培养基）。

（3）注意：剩余的本产品可以等分成工作体积，并储存在-20 ℃。在以后的试验中根据需要解冻相应体积的本产品。避免反复冻融本产品。

（4）对于原代海马神经元培养，神经元培养基（由前述步骤制备）需要额外补充25μM的L-谷氨酸，在培养的第4天以后的换液中应不再添加谷氨酸。配置好的培养基，可于 2-8 ℃的避光保存一周。

二、细胞培养步骤

下列步骤已在大鼠胎儿原代皮层神经元中测试。

（1）用无菌的冷的 0.05 mg/L 多聚赖氨酸水溶液包被培养表面（玻璃或细胞培养级塑料），每平方厘米表面使用 0.15mL，37℃放置过夜 (16 h)；

（2）去除多聚赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水冲洗两次（须清洗，因为多聚赖氨酸对细胞有毒性）。在超净工作台中打开培养板的盖子通风，直到每个孔都干燥。培养板干燥后可以立即使用或在4℃ 最多保存 2 周。

（3）根据实验室标准操作流程从胚胎 16-18 days 的大鼠中分离获得原代海马/皮层神经元细胞，或参考细胞株提供的说明书解冻冻存的原代大鼠神经元细胞。

（4）将神经元培养基在 37℃的水浴锅中预热，建议细胞接种密度为 2x105 个/孔（24 孔板为例）或根据自身实验对密度进行调整。

（5）在将接种了细胞的培养皿放置于 37ºC，5% CO2的培养箱中培养。

（6）在接种 16-24 h 后，更换一半体积的新鲜的培养基，之后 2-3 days 换液。

三、分离原代大鼠胚胎神经元

下列程序推荐用于培养受精 18 天的大鼠胚胎海马神经元和大脑皮层神经元。

（1）从受精 18 天的大鼠胚胎中分离大脑皮层和双侧海马。

（2）在预置了培养基的锥形管中收集所有的组织。放置，直到所有的组织都已解体。

（3）使组织沉积在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下刚好可覆盖组织的最少量的培养基。

（4）在不含钙离子的培养基中，使用 2 mg/L 过滤灭菌的木瓜蛋白酶溶液，在 37 °C 下酶解组织约 30 min，期间轻摇锥形管以帮助降解，5 min/次。每对海马组织使用 2 mL 酶溶液。

（5）加入两倍体积的培养基以恢复二价阳离子的浓度，停止酶解。

（6）使未解离的组织沉降至管底（约 2 min），然后把上清液转移到 15 mL 离心管中，离心，150×g，5 min。

（7）在 1 mL 神经元培养基中重悬沉淀物，取 10 μL 进行细胞计数。后续的操作按照“复苏和培养冻存的神经元”的第 8-10 步骤进行。

四、复苏和培养冻存的神经元

重要提示：原代神经元细胞将会贴附在裸露的塑料或玻璃表面，建议事先用神经元培养基冲洗所有的塑料和玻璃器皿的内表面，以获得最高的回收率和产量。

由于细胞从冻存状态复苏时极其脆弱，请在整个操作过程中不要震荡或离心细胞。我们建议每次只解冻一管细胞。务必减少从液氮中转移冻存管到 37ºC水浴中的操作时间。

（1）在解冻细胞之前，用神经元培养基冲洗无菌的 15 mL 锥形管，然后在超净工作台中通风晾干。

（2）从液氮中取出冻存管时可稍微拧松管帽以释放压力，然后再拧紧。

（3）在 37 °C 水浴中轻柔搅拌冻存管以快速解冻细胞（小于 2 min）。当观察到冻存管中只有很少量的冰晶存在时（触摸冻存管仍然感觉是冷的）从水浴中取出。

（4）在工作台台面上轻敲冻存管以使管内液体沉降到管底。使用事先用神经元培养基冲洗并干燥过的 1 mL 吸头极其轻柔地将细胞转移到事先冲洗并干燥的 15 mL 锥形管中。

（5）用 1 mL 预热的神经元培养基冲洗冲洗冻存管，以每秒一滴的速度极其缓慢地加入到 15 mL 锥形管中的细胞里。每加一滴都轻柔地转动锥形管一次。不要一次即把全部培养基加到锥形管中。

（6）慢慢地逐滴加入另外 2 mL 预热的培养基，使管内的液体体积为 4 mL。用 1 mL 吸头轻柔地混合液体，注意不要造成任何气泡。

（7）用一个事先冲洗干燥过的吸头吸取 10 μL 细胞悬液加入到含有 10 μL ，0.4 %台盼蓝的微量离心管中，轻敲管壁以混匀溶液。使用手动的细胞计数方法测定活细胞密度。解冻的细胞的活率应超过 50 %。

（8）在已经事先用多聚赖氨酸包被（参见“细胞培养步骤”）的 24 孔板中每孔中接种大约 2x105 个细胞或按所需的细胞密度接种。加入预热的神经元培养基将细胞悬液稀释到每孔 500 μL。按照“细胞培养步骤”中的 5-6 步骤进行神经元的培养。在 37ºC，含 5 %CO2 的培养箱中培养。

五、产品目录表

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