利用Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法分离纯化 IgG1
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Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 是利用在中性 pH 环境中 Q SepharoseFast Flow 更倾向于结合小鼠腹水中的非目的蛋白,故在用盐溶液梯度洗脱时,McAb 会较早被洗脱或出现在穿过液中,从而可得到分离纯化的 IgG1。
原理
Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 的基本原理是 Q Sepharose Fast Flow 为强阴离子交换介质,具有流速快(最高流速 750 ml/min)、高量(120 mg HAS/ml)的特点。
小鼠 IgG1 的 PI 范围为 pH7.0~8.5,而白蛋白和转铁蛋白的 PI 范围为 pH4.7-5.0,因此,在中性 pH 环境中 Q SepharoseFast Flow 更倾向于结合小鼠腹水中的非目的蛋白。故在用盐溶液梯度洗脱时,McAb 会较早被洗脱或出现在穿过液中,从而可得到分离纯化的 IgG1。
材料与仪器
器材:0.45μm 滤膜、XK 16/20 层析柱,FPLC 层析系统。
试剂:
① Q Sepharose Fast Flow 强阴离子层析分离填料。
② 起始缓冲液:0.02mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH7.5。
③ 洗脱缓冲液:1.0mol/L NaCl-0.02mol/L Tris- HC1 缓冲液,pH7.5。
④ 再生溶液:0.1mol/L NaOH。
步骤
Q Sepharose Fast Flow 离子交换层析法纯化 IgG1 的基本过程可分为如下几步:
(1)样品准备
A 小鼠腹水离心去杂质,饱和硫酸铵盐析并除盐,0.45μm 滤膜过滤。
(2)分离纯化
A 按照 Q Sepharose Fast Flow 生产厂家提供的说明书处理填料,按照 XK 16/20 层析柱使用说明书进行装柱。
B 以 5 ml/min 的流速,用起始缓冲液充分平衡层析柱,至流出液的 pH 值与初始缓冲液相同,约 3 倍层析柱体积,走出一稳定基线。
C 上样后,采用 2 ml/min 的流速,以 2-3 倍层析柱体积的起始缓冲液洗掉非结合蛋白,即穿过液中检测不到蛋白峰。
D 以 5 ml/min 的流速加入洗脱缓冲液,则 NaCl 浓度形成连续梯度,IgG1 将首先被洗脱而流出层析柱。
E 纯化的 McAb 可经超滤离心管浓缩,BCA 法测定 McAb 蛋白含量,分装冻存。
F 洗脱结束后,以 5 ml/min 的流速,2-5 倍层析柱体积的再生溶液对层析柱进行再生。用初始缓冲液重新平衡层析柱,以备下次使用。
注意事项
1.纯化前所有缓冲液、样品及层析柱都必须平衡至室温,以避免产生气泡。
2.纯化前样品、缓冲液须用 0.45μm 滤膜过滤去除颗粒性物质,以防层析柱被堵塞而降低纯化效果。
3.不同类 McAb 的等电点变化范围较大,即使在同一类的不同亚类 McAb 之间,其等电点也有较大差异(表 1-3)。因此,在纯化不同类或亚类的 McAb 时,还须进行纯化条件的优化。
4. 为确保层析柱的使用寿命和载量,及时清洗非常重要,清洗完成后用起始缓冲液重新平衡。
5. 层析柱可于 4℃、20% 乙醇中长期保存。
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