如何确定发光测量的微孔板间的交叉污染？

北京亘辰科技有限公司  Frank Han

    过去十几年，发光实验因具有*的特异性及灵敏度，且简单易用，多应用于药物开发研究。现代光学测量仪器，即便发光底物的光子发射水平极低依然能够准确进行计数。引起研究者们对SBS / ANSI标准微孔板设计中固有的光学干扰以及信噪比的极大关注。这篇短文比较了三个不同品牌制造商的微孔板中观察到的光学干扰，发现使用黑色基底孔板可显着提高检测的灵敏度。

分光光度法

    该研究比较了两个不同品牌制造商的固体白色聚苯乙烯矮板与获得的Porvair Sciences设计的白色单孔与实心黑色基底板的组合（图1）。用萤火虫荧光素酶的发光测定做对比。有三种基于微孔板检测获得光学数据的方法。zui简单的方法是吸光度测量。根据Beer-Lambert定律，测量透射或吸收的单色光，可简单测出每孔中的相对浓度。酶标仪使用原理。

图 1. Porvair *的白孔黑底96孔荧光检测板

    荧光检测灵敏度更高。在荧光计中，简单的截止滤波器可以从检测光中去除反射的激发波长，仅留下发射波长。灵敏度却是吸光度测量法的10倍以上。通过使用单色仪降低激发和发射波长的带宽来实现更高的灵敏度。这种荧光计可以增加一个数量级的灵敏度。

生物发光是某些动物和植物物种展示的自然发光现象，有水母发光蛋白和萤光素两种常见发光机制。通过用荧光素酶基因构建转染细胞，荧光素酶可以用作报告基因以评估细胞内的转录活性或为高通量筛选提供测定细胞凋亡的ATP浓度，检测非常灵敏。这种发光测定法由几家生命科学公司以AequoScreen ^TM，LucLite ^TM，ATPLite ^TM，OneGlo ^TM命名。发光计或多标记读取仪是能够读取吸光度，荧光或发光模式的多用途光谱仪。图2为三种光学检测方法。

图2:光度法检测

微板设计考虑

    用于检测开发和高通量筛选的微孔板通常由聚苯乙烯聚合物制造。

    当在筛选中使用荧光素酶在孔板上观察高动态范围出现困难时，相邻的孔若显示过强或过弱的信号，会导致孔之间的光学干扰，而得出错误的结果。一定量的可见光通过板的白色塑料孔壁“泄漏”，低信号也会在相邻孔板中被错误附加而被检测到。当读取与低浓度信号相邻的更亮的孔时，误差zui大。使用分离的“烟囱”设计可以减少这种误差，但却不能消除误差。图3显示Porvair白色固体96孔“烟囱”板（左图）。每个孔具有与板矩阵分离的单独形成的孔壁。

为了克服白色塑料孔壁的光“泄漏”问题，Porvair Sciences开发*的96孔黑底白孔板并获得了。（图3右图）。的“双射”工艺技术使得黑色聚苯乙烯板基底与白色孔板结合。这种“双射”模具也用于制造具有透明底板的白色或黑色孔壁的荧光检测板，Porvair Sciences Krystal 2000^TM零干扰板便是底部读取吸光度和荧光检测的耗材。其配方中含有高达18％TiO₂的亮白色孔板结合1％炭黑基底上，该板的光学干扰全部被消除。

数据表明：Porvair的黑底白孔板与其他两个制造商的固体白板相比较，黑白板的孔间干扰分别降低82％和56％。

研究方法

在BMG Labtech的POLARStar Omega光谱仪使用5ul含有荧光素和萤火虫荧光素酶的溶液移液到每个96孔板的C4孔中（在下面的数据中显示为“P”）并在510nm处读数。加入5uL等分的过氧化氢反应。从每个样品孔周围的空的孔中读取四个数值，每个读数持续1秒，取平均值。荧光素酶信号在8-10分钟内快速衰减，信号下降到几乎为初始水平的50％时读数。

每个实验准备一个板，注意从未开封的包装中选择干净板。其他品牌的孔板重复该流程。使用相同类型的空白板做背景读数以进行信噪比计算。

图3. 样品位置和样品周围的各个测量位置

结果

Porvair 96孔黑白板的计算信噪比为192000：1，而实心白板的信噪比为178000：1，背景显示有用的可测量信号增加7.5％。

结论

   结果清楚地表明，Porvair科学的复合黑底白孔板提供了用于筛选和药物开发中低水平荧光素酶的测定。通过炭黑的有效淬灭和二氧化钛增加反射率的组合产生*的信噪比和*的动态范围，使筛选者有机会在较低的检测水平或减少试剂浓度的情况下筛选微弱的信号。

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关于Porvaier-Sciences

    Porvair-Sciences，微孔板产品的制造专家，服务生命科学，生物技术，医药研发和分子生物学的微孔板解决方案的所有应用，也为各*生物公司设计zui通用的过滤板，包括Waters，Millipore，Qiagen，Whatman，GE Healthcare，Varian，Biotage、当然还有Porvair。