使用蛋白质沉淀和固相提取技术制备生物样品

北京亘辰科技有限公司  Frank Han

介绍

利用LC-MS系统进行微小分子的定量分析，需要从血清、血液、尿液、精液、脊髓液和其他离体样品中去除无用的生物分子。主要是蛋白质，因为蛋白质大分子容易变得粘稠并且可能堵塞色谱柱中的小孔。

色谱法

色谱法是生命科学研究中定量分析的标准分离技术。蛋白质会破坏液相色谱或气相色谱，血清中还含有称为磷脂的其他脂肪酸衍生物，也较粘稠且会堵塞色谱柱。

Porvair Sciences开发出两种类型的96孔板，可从体积高达2ml的血清样品中去除蛋白质，可解决蛋白质在色谱柱中的问题。96孔P3板或蛋白沉淀板zui简单有效、价格低廉；而C18 SPE板则更先进，也更昂贵。

选择何种孔板和方法取决于样品，及所需的灵敏度和期望的分析值。

通常，在P3板上制备的样品适合于标准LC-MS系统检测，而在C18 SPE板上处理的样品更适合于毛细管柱的高灵敏度QTOF和LC-MS分析。如果使用质谱仪，则会出现磷脂和蛋白质的污染问题。

LC-MS

 LC-MS是用于检查血液或血清样品中低浓度的类药化合物和代谢物的一种常见技术。在低浓度时，磷脂问题突出，一组称为溶血磷脂（去除更复杂）可导致检测到的LC-MS信号的不一致。

离子抑制是由溶血磷脂引起的，其中由这些物质诱导的高背景信号掩盖由分析物产生的实际信号。离子抑制可以增加和减少分析物信号，使其难以校正。

蛋白沉淀技术

P3板在蛋白质沉淀技术中能有效去除蛋白质，但不能成功去除磷脂和溶血磷脂。使用乙腈或甲醇使蛋白质变性。蛋白质从溶液中“沉淀”并集结成大的粘性球体，直到使用真空将含有所需分析物的液体推进过滤器，zui后进入收集板。

固相萃取

固相萃取（SPE）是一种传统技术，使用P3板需要额外的调节和清洁过程，耗时且更难自动化。而C18二氧化硅能够从样品中去除几乎所有的磷脂。本文检测了用于去除磷脂的不同材料的适用性，标准C18硅胶与两种不同的树脂进行比较。

评估C18硅胶板去除磷脂

使分析物容易通过，在吸附剂上保留磷脂。分别用HPLC和比色法测定分析物和磷脂的浓度。阳离子交换混合模式树脂可用作吸附剂：

树脂1

A  PCX树脂，混合阳离子交换树脂，用于初始测试组。使用磷脂酰胆碱标准物来评估磷脂的去除。传统的蛋白质沉淀和PCX树脂与P3的杂合物的比较，中性，酸性和碱性甲醇作为沉淀溶剂。

结果表明，传统的蛋白质沉淀不能去除任何磷脂，而当与酸性或中性有机溶剂一起使用时，PCX树脂能去除大于90％的磷脂。

树脂2

使用酸性，中性和碱改性的有机溶剂检查PRP X400树脂的磷脂保留。

鉴于PRP树脂是用磺酸盐基团改性的二乙烯基苯，其去除磷脂的性能极差。

结果表明，选择适当地阳离子交换树脂，可以很好的去除磷脂。相互作用在约75％有机溶剂产生3:1蛋白质沉淀。基于C18二氧化硅足够的吸附性， P3板有良好的磷脂保留。

初始研究C18的磷脂去除

实验1

将600μl的甲醇中混入1mg / ml磷脂酰胆碱并加入到入C18微孔板的孔中，加入200μl蒸馏水，并使用Porvair Sciences的真空歧管在真空下将混合物抽吸通过C18层。使用Porvair Sciences Miniivap氮气干燥站收集并蒸发滤液，然后在600μl chloroform中重构，做磷脂测试。

结果表明，甲醇与水的比例为3：1，可以去除约90％的磷脂。再用acetonitrile代替甲醇进行实验，结果表明没有保留磷脂。选择合适的板去除磷脂至关重要。

实验2（从猪血浆中除去磷脂）

通过将200μl血浆注射到600μl甲醇中制备6个猪血浆样品。然后将这些样品离心以除去沉淀的蛋白质，并收集上清液。

使用Minivap将所有样品在氮气下蒸发，并在600μl chloroform中重建，用于磷脂检测。对于两种C18，磷脂的浓度降至低于10μg/ ml的检测极限。

实验3（分析物回收）

使用三种皮质类固醇，即泼尼松龙，皮质酮和地塞米松，来评价分析物的回收率。然后在75％水/甲醇中制备20μg/ ml的皮质类固醇的溶液。将1ml的分析物溶液通过C18过滤，收集滤液并使用HPLC检查滤液。

结论

上述所有实验表明，使用C18树脂是去除磷脂的可行方法。典型的3:1甲醇与血浆的沉淀比可除去大部分磷脂，同时大多数分析物容易通过。研究表明，C18吸附剂和P3组合可以提供一种合适的去除磷脂的方法，但是需要更多的研究来确定从这些样品中去除溶血磷脂。