牛呼吸道疾病（BRD）在两周到六个月大的犊牛中很常见，是造成牛犊和饲养场牲畜死亡的主要原因（Johnson等，2011； Larsen）等，1999； Virtala等，1999）。 BRD涉及多种病原，包括牛呼吸道合胞病毒（BRSV），牛冠状病毒（BCoV），3型牛副流感病毒（BPI3），溶血性曼海姆氏菌，多杀巴斯德氏菌，索氏嗜血杆菌和牛支原体（Angen等，2009； Frisis和Krogh，1983；Kusiluka et al。，2000; Larsen et al。，1999; Tegtmeier等，1999）。 牛疱疹病毒1（BoHV-1）和牛病毒性腹泻病（BVDV）也可以是致病的病原，但是这些病原已在包括丹麦在内的多个国家中被*。

在美国，超过90％的牧场会受到BRD的影响，据报道在中大型澳大利亚牧场中BRD的发生率为18.2％（Hay等人，2014）。 2014年，丹麦奶牛的估计死亡率为7-10％，而BRD被认为是造成10-35％死亡的原因（Grønbæk等，2016）。在近的调查中，爱尔兰研究中10％的小牛死亡率归因于BRD，英国的BRD患病率为45.9％，发病率为10.1％（Johnson等，2017）。可以通过几种策略来控制BRD，例如正确使用初乳（Pardon等，2015）或接种疫苗计划（Richeson等，2008）。抗生素在BRD治疗和控制中的广泛使用（De Briyne等人，2014）是抗生素在经济动物中的主要用途之一（Fulton，2009； Nickell和White，2010）。 BRD是与宿主易感性，环境条件，管理以及病原载量等多因素相关。感染会导致呼吸道发炎并损害呼吸道，严重的会导致死亡。发病机理被认为是原发性病毒感染和随后上皮细胞引起的细菌性继发性感染（Angen等，2009; Sudaryatma等，2018）所致。病毒与免疫系统的相互作用会导致免疫抑制，从而削弱宿主对继发性细菌感染的免疫反应（Czuprynski等，2004）。 BRD的现场诊断基于临床症状，临床标本的微生物学诊断适合多种样本，例如气管抽吸液，鼻拭子和肺组织样本。然而，通常会遇到假阴性结果，因为细菌可能是互相竞争或生长缓慢，并且可能其他细菌生长更快（Bell等人，2014; Kugadas等人，2014; Shanthalingam等人，2014; Tegtmeier等人，2000）。尽管经常使用诸如ELISA之类的血清学检测方法来表明牛先前感染过牛分枝杆菌，但由于血清产生抗体通常需要两周或更长时间，因此在早期感染中会出现假阴性结果（Howard等人，1986; Petersen等人，2018）。已经开发出了广泛的聚合酶链反应（PCR）分析方法来单独测试BRD中涉及的每种病原（Amer等人，2013; Bell等人，2014; Klem等人，2019; Kishimoto等人（2017年； Rahpaya等人，2018年）。然而，对于单一靶向PCR来分别检测多种BRD病原成本非常昂贵。为了克服这个问题，近开发了一种多重PCR检测方法（Zhang等，2017）。尽管个别细菌或病毒可以单独导致疾病，但混合性感染在BRD中常有放生。实现对这些病原的快速诊断对于实施适当的治疗和控制措施也至关重要。常规PCR是有问题的，因为在健康和患病的牛犊中都可能存在病原。在多种病原同时存在的情况下，临床标本中病原的定量检测大大增加了微生物诊断的价值（Lima等，2016； Pedersen等，2014，2013）。

近，发表了一种用于检测BRD相关细菌病原体的多重定量PCR（qPCR）方法，证明在与两种或多种病原共感染时，其qPCR检测性能优于培养方法（Loy等人，2018）。DNA Diagnostic A / S公司为了提供一种可以快速检测多种BRD病原方法，已经开发了Pneumo 4多重病原qPCR检测方法。Pneumo 4检测试剂盒分Pneumo 4B（细菌）和Pneumo 4V（病毒）两管检测，可以分别快速地特异性地同时检测和定量与BRD相关联的四种细菌（溶血性曼海姆氏菌，多杀巴斯德氏菌，睡眠嗜组织菌Histophilus somni，牛支原体）和五种病毒（BPI3，BCoV，BRSV，BoHV-1和BVDV。对这9种病原的检测可在同一反应条件下分2管PCR反应完成，与并行运行的多个单重qPCR分析相比，诊断实验室在成本和处理时间方面具有优势。

Pneumo4B和Pneumo4V每次检测分别能够检测10个拷贝的基因组DNA和10-50个拷贝的靶RNA，这与以前建立的报告每个反应100-250个拷贝的方法具有可比性（Rahpaya等人，2018） 。 Pneumo4B检测表明，许多气管抽吸液（TA样品）对溶血支原体，多杀性巴氏杆菌或沙门氏菌PCR呈阳性，而通过培养方法呈阴性。这些结果表明存在细菌，但由于其培养基的倾向性或培养中其他细菌过度生长而无法被检测到（Bell等人，2014; Van Driessche等人，2017）。Pneumo4B的PCR方法可能会克服伴随的菌群的影响，并在传统培养失败的混合样本中检测到病原（Loy et al，2018）。确定Pneumo4B的诊断特异性和敏感性时，必须考虑将培养物作为参考标准测定法的局限性。如果Pneumo4B正确地鉴定了培养未检测到的细菌种类，则Pneumo4B分析的特异性将被低估。如先前报道，少数样品通过培养对细菌呈阳性，而在Pneumo4B分析中呈阴性，证实qPCR可能导致假阴性结果，如先前报道（Bell et al，2014）。对此的解释可能是引物/探针错配，在储存或处理过程中核酸降解或在提取过程中出现技术错误。大多数培养阳性/ PCR阴性样品含有少量细菌，这可能是与用于培养的较大体积样品相比，DNA提取样品量较少的结果。但是，某些目标细菌可能在引物或探针识别位点具有序列变异。 PCR抑制剂也可能导致了这些结果，因为我们发现一些培养阳性/ PCR阴性的样品来自内部扩增对照（IAC）的PCR信号低得令人无法接受（无信号或Ct> 32），DNA提取物的5倍稀释液并在重新测试后变为PCR阳性。但是，在我们的方法比较中，我们将此类样品归类为PCR阴性。与参考方法相比，通过Pneumo 4B进行的牛支原体qPCR测试在气管抽吸液（TA样品）中检测出更多阳性。我们不能排除Pneumo 4B可能与其他支原体物种发生交叉反应的情况，而在当前的研究中尚未对此进行测试。但是，在两种方法均为阳性的样品中，Pneumo4B的结果比标准PCR的结果低3–4 Ct值，这表明该检测方法对牛支原体的灵敏度比参考方法高。影响PCR扩增效率的因素有很多，例如样品的存储和运输和DNA提取方法差异（Bowman等，2016; Dilhari等，2017）。

DNA Diagnostic A / S公司采用经过国家兽医实验室认可的丹麦单重分析qPCR病毒检测方案作为参考标准。与这些标准方法相比，Pneumo 4V多重检测的灵敏度相同或稍高。某些样本在Pneumo4V PCR中对BPI3，BCoV或BRSV呈阳性，而在标准PCR中呈阴性。而只有一例标准PCR呈阳性，而Pneumo4V呈阴性。这些阳性样品的Ct值为30以上。我们不能排除通过交叉污染或与本研究中未测试的其他病毒物种的非特异性扩增可能产生高Ct的可能性。但是，丹麦养殖场的样本上验证了Pneumo 4V的诊断敏感性和特异性有一个限制，因为丹麦没有BoHV-1和BVDV病毒感染了。因此，无法评估BoHV-1和BVDV的诊断敏感性。在Pneumo 4V和标准PCR中，所有TA样品的结果均确实对BoHV-1和BVDV阴性，表明在Pneumo 4V中对这两种病毒的检测与丹麦的其他牛呼吸道病毒没有交叉反应。对于在没有BoHV-1 / BVDV的国家/地区常规使用，重要的是BoHV-1 / BVDV检测方法必须具有高特异性，因为假阳性检测可能会对监管和贸易产生影响。需要进行其他研究以评估Pneumo 4V对含有BoHV-1和BVDV的临床样品的敏感性。