酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本。该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将这一待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大，对数放大，模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，后由显示器和打印机显示结果。微处理机还通过控制电路控制机械驱动机构X方向和Y方向的运动来移动微孔板，从而实现自动进样检测过程。而另一些酶标仪则是采用手工移动微孔板进行检测，因此省去了X,Y方向的机械驱动机构和控制电路，从而使仪器更小巧，结构也更简单。

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示， OD是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD=log(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系:

E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度， Ιo 为在检测物之前的光强度，Ι为从被检测物出来的光强度。

OD值由下述公式计算:

c为检测物的浓度 b为检测物的厚度 a为摩尔因子在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

OD值由下述公式计算:

c为检测物的浓度 b为检测物的厚度 a为摩尔因子在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。