操作步骤如下：

1 液体石蜡的准备 选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：121℃湿热灭菌30min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。

2 斜面培养物的制备   参照定期移植法。

3 灌注石蜡  将无菌的液体石蜡在无菌条件*入培养好的新鲜斜面培养物上,液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。

4 保藏 4.1　注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间2～10年。 4.2　保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。

5 恢复培养   恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。

仪器设备与器具：

1 恒温培养箱：36±1℃。

2 1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管。

3 接种针。

4 显微镜。

5 超净工作台。

6 玻片、酒精灯、洗耳球、试管架。

7 天平：感量0.01g。

8 灭菌釜。

9 培养皿（直径为90mm）、试管，经121℃、30分钟灭菌。

10试管夹、酒精灯、秒表、载玻片

基本概念：

(1)菌群：由多种细菌混合组成的相对稳定的细菌群体，具有某些共同性状。如大肠菌群包括大肠杆菌、产气肠细菌及他们之间的过渡类型。

(2) 菌属：菌种的上一级分类，通常性状相近、亲缘关系密切的若干菌种组成一个菌属，如芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属等。

(3)是细菌最基本的分类单位，通常指表型特征相似、亲缘关系接近的一类细菌群体，与同属内其他种有着明显差异；当涉及到细菌保存时，菌种是指细菌的种子（用来长期保存）资源。

(4) 菌型：同一菌种的不同细菌，在某些方面存在较小差异的为同一菌型，通常一个菌种内的细菌可以分为多种不同的菌型。

(5) 菌株：由一个独立分离的单细胞系培养而成的纯遗传型群体及其一切后代，一种微生物的每一个不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。

培养及打管说明：

1、安瓿瓶开封：用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。

2、菌株恢复培养：用无菌吸管吸取0.3--0.5ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液，移植于1-2支建议的培养基试管中，并在建议的条件下培养。

3、注意事项：菌种活化前，请将安瓿管保存在6-10℃的环境下，某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需要连续两次继代培养才能正常生长

4、复苏后的菌种在传1-2代后使用。

5、暂不启开的安瓿及复苏后需保藏的斜面应于4℃中保藏。

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