药物研发过程中常涉及到复杂样本的高通量检测，如在药物早期研发阶段使用全长蛋白/多元复合物、临床前用血清/血浆样本进行PK检测、ADA检测等，在进行复杂样本尤其是血清/血浆样本的高通量检测时，瑞孚迪AlphaLISA可为您提供简单便捷且准确的高通量检测方法！

瑞孚迪均相免洗技术包含HTRF和Alpha，Alpha除了具备均相免洗技术无需洗涤、信号稳定、灵敏度高、易于自动化等优势外，还适用于复杂样本的高通量检测。下面小编就带你走进瑞孚迪Alpha技术，展示它的魅力！

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什么是Alpha技术？

Alpha (即Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) 是一种基于微珠的高灵敏度均相检测技术，该技术使用供体和受体两种微珠，当结合于供体微珠上的分子1与结合于受体微珠上的分子2发生相互作用，距离<200 nm时，即可检测出发光信号，该技术突破了其他反应体系的局限性，不但可以检测常规的小分子相互作用，如抗原抗体、第二信使、配体、细胞因子与受体间相互作用，还可以用于检测完整蛋白质、酶复合体、噬菌体等相对分子质量巨大或非常复杂的复合物和相互作用。

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Alpha技术检测原理

Alpha技术供体微珠表面含有化学物质光敏剂，在680 nm的光激发下，将周围的氧气分子 (O2) 变成单线态氧 (1O2)，单线态氧在溶液中扩散将能量传递给200 nm范围以内的受体微珠，引发一系列级联放大的化学反应，从而产生特定波长的光。以AlphaLISA细胞因子检测试剂盒为例，当待检样本中含有相应细胞因子时，供体微珠和受体微珠可特异性与该细胞因子结合，从而拉进供受体微珠的距离，引发受体珠中的级联能量转移，导致在615 nm处出现尖锐的发光峰值，AlphaLISA检测信号则与样本中存在的细胞因子的量成正比，原理图如图1所示。

图1. Alpha技术检测原理

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Alpha技术分类

在Alpha技术中，供体微珠是相同的，受体微珠根据表面化学染料的不同，可分为四种类型：

1.AlphaScreen——第一代Alpha技术

受体微珠化学染料：红荧烯；发射波长：520-620 nm

2.AlphaLISA——升级后的Alpha技术

受体微珠化学染料：铕Eu；发射波长：615-623 nm

相比于AlphaScreen的宽波谱，AlphaLISA受体微珠所在的波长区域 (615-623 nm) 可有效避免血清和血浆样品的荧光背景干扰 (波长区域300-600 nm) 以及氧合血红蛋白的吸收干扰 (波长区域<600 nm)，适用于各种临床前和临床中血清和血浆样本的高通量检测。

3.AlphaPlex 545——Alpha技术的多重检测

受体微珠化学染料：铽Tb；发射波长：515-555 nm

供体微球与AlphaLISA、AlphaPlex 545 和AlphaPlex 645 受体微球相互作用，可以在一个微孔板孔内检测2-3种指标。

4.AlphaPlex 645——Alpha技术的多重检测

受体微珠化学染料：钐Sm；发射波长：645 nm

供体微球与AlphaLISA、AlphaPlex 545 和AlphaPlex 645 受体微球相互作用，可以在一个微孔板孔内检测2-3种指标。

四种受体微珠的发射波谱示意图如下：

图2. 四种受体微珠的发射波谱

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Alpha技术应用案例

案例一 血清样本非洲猪瘟检测方法建立

非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组范围在170~190 kb之间，共注释了151个基因，衣壳蛋白p72是ASFV自然感染的主要免疫原，是ASFV免疫诊断试验的候选分子。本实验建立AlphaLISA具有高灵敏度、强特异性和强相关性，对快速准确检测ASFV具有良好的应用前景[1]。

标准曲线的建立

分别两倍连续稀释ASFV p72 (100~1.5625 ng/ml) 和ASFV阳性血清 (1：2~1：256) ，如图3显示，AlphaLISA信号与ASFV p72及ASFV阳性血清稀释度之间存在良好的线性或非线性关系。

图3. p72的标准定量曲线 (A) 和ASFV阳性血清倍比稀释曲线 (B)

Cut-off值、灵敏度和特异性

通过20份SPF猪血清确认AlphaLISA检测方法的cut-off值为264.05，检测下限（灵敏度）为0.78 ng/ml。并进行交叉反应实验验证 (CSFV、 PRV、PRRSV、PPV、PCV2和PEDV) 以证明AlphaLISA方法的特异性和准确性，结果如图4所示。

图4. p72 cut-off值和交叉反应实验结果

方法评估

采用AlphaLISA、Real-Time PCR检测和抗原检测试剂盒分别检测60份临床血清样本，Real-Time PCR检测结果显示，29份ASFV阳性，31份ASFV阴性；抗原检测试剂盒结果显示ASFV阳性24例，ASFV阴性36例，而AlphaLISA结果显示ASFV阳性27例，ASFV阴性33例。与Real-Time PCR检测相比，AlphaLISA的敏感性为93.1%，特异性为100%，相关系数为0.967，与抗原检测试剂盒相比，AlphaLISA的敏感性、特异性和相关系数分别为100%、91.7%和0.95。

案例二 PBMC上清细胞因子检测

PBMC通常用作体外模型筛选和鉴定针对靶向免疫途径的药物，因此，测量PBMC细胞模型的细胞因子分泌的能力往往需要灵敏、稳定的检测方法。本案例使用高灵敏度和稳定性的AlphaLISA 高性能细胞因子检测试剂盒，是细胞因子研究，实现以小样本量准确检测简单到复杂基质中的内源细胞因子。

本实验涉及到AlphaLISA高性能版细胞因子检测试剂盒Human IFN-γ (#AL3153), Human IL-2 (#AL3155), Human TNF-α (#AL3157), Human IL-10 (#AL3159), Human IL-1β (#AL3160), Human IL-17A (#AL3161), Human CXCL10(#AL3163), and Human IL-8 (#AL3164)等细胞因子检测试剂盒。

实验结果

收集了所有测试细胞因子的数据后，计算LDL和LLOQ值。如图5所示，所有的试剂盒的LLOQ都达到pg/mL级别的高灵敏度。

图5. 检测下限和定量下限列表

在图6中可见，以IL-2为例，PBMC上清待测样本可进行大倍数稀释或不稀释，都能获得较大的实验窗口。因此，当需要在一个样本中检测多个细胞因子时，则可以选择相同的稀释倍数来稀释样本后再分别进行检测，可减少多种稀释倍数带来的实验干扰与误差，从而更快速准确地获得多个细胞因子的检测数据。同时又因为AlphaLISA检测只需要5-10 ul的样本量，一个96样本孔的上清足够同时支持多个细胞因子的检测，大大节省PBMC的使用成本。同时，均相免洗的实验操作以及小体积的检测更兼容自动化仪器，实现真正的高通量样本检测。

图6. 检测梯度稀释PBMC上清中的IL-2

案例三 PROTAC三元复合物结合实验

AlphaLISA tool box试剂可以成功地用于检测靶向蛋白降解应用的三元复合物形成，筛选用于药物发现的PROTAC分子。当靶蛋白和E3连接酶通过PROTAC成功地以三元复合物的形式连接时，抗标签供体和受体微珠将靠近并产生Alpha信号。

图7. AlphaLISA三元复合物结合实验模型

案例以BRD4和CRBN三元复合物结合实验为例，介绍AlphaLISA在三元复合物检测中的应用。该实验的BRD4蛋白为重组GST-BRD4，CRBN复合物为重组人Cereblon/DDB1/Cul4A/Rbx1复合物，在Cereblon和DDB1亚基上带有N端flag标签，在Cul4A和Rbx1亚基上带有N端6x His标签，作为E3连接酶。

如图8所示，PROTAC dBET6的滴定显示出钟形曲线，在~100 nM处观察到钩点。PROTAC dBET1也产生了钟形曲线，表明与该PROTAC成功形成三元复合物，然而，钩点略有增加(~250 nM)，表明dBET1形成三元复合物的效率低于dBET6。先前的研究提出dBET6比dBET1更有效的降解物，dBET6处理的细胞中蛋白降解更加明显。相反，不相关的PROTAC：MT-802及对照分子则没有AlphaLISA信号。

图8. 三元复合物中PROTACs的滴定

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仪器推荐

VICTOR®Nivo™Alpha

VICTOR®Nivo™Alpha是一款性价比高，检测效果佳的Alpha仪器。对于从事Alpha检测的实验室，这款仪器将是您

最新的VICTOR®Nivo™多模式微孔板读板仪配置了高灵敏Alpha技术的所有硬件：680 nm激光光源用来激发供体微珠，D660专业二向色镜和Alpha 专用发射滤光片。同时，VICTOR® Nivo™通过特殊的设计，阻拦激发时发射信号的检测，从而降低了背景信号。

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微孔板推荐

瑞孚迪AlphaPlate浅灰色微孔板，专为瑞孚迪AlphaLISA和AlphaScreen检测技术而设计，是目前采用浅灰色设计的微孔板，可显著降低信号交叉干扰多达17倍，优化检测信号信噪比值并提高整体Z'值。

如果您对Alpha技术感兴趣，或需要更详细的产品资料，可以联系上海玮驰。

参考文献

[1] Dongjie Chen, Di Wang, Caixia Wang, F. Wei, Hongyuan Zhao, Xiangmei Lin, Shaoqiang Wu less. Application of an AlphaLISA method for rapid sensitive detection of African swine fever virus in porcine serum. Applied Microbiology and Biotechnology. 29 May 2021. DOI:10.1007/s00253-021-11339-2