主要内容

1利用布鲁克的单细胞光导系统实现上千个MSC单细胞的分离、培养、表型特征鉴定和回收。

2通过单细胞光导系统获得克隆的关键质量属性（CQA），包括生长、克隆形成潜能以及多系分化潜力。

研究背景

间充质干细胞（MSCs）自从50多年前被分离和鉴定，已显示出巨大的临床潜力。MSCs具有可以分化成多种细胞类型的能力，包括成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。此外，它们免疫调节和抗炎特性使其适用于免疫治疗和再生医学，并成为组织工程领域的一个重要组成部分。

然而，观察到的供体间、组织来源间以及细胞群体内的异质性对MSC作为再生疗法的使用提出了挑战，并可能影响其治疗效果。当细胞暴露于相同的刺激或环境条件下时，随机过程可能导致截然不同的反应。因此，传统的测量MSC属性的bulk方法可能会掩盖细胞间的异质性。还需要确定是否可能纯化出更均一、更有疗效活性的细胞群体。

通过与新加坡A*STAR的IMCB团队合作，我们利用布鲁克细胞分析的单细胞光导系统，高精度操纵和分离单个细胞，并为单细胞生长提供适当的环境，来应对体外MSC扩增和当前单细胞表型分析的局限性所带来的挑战。这项技术无缝集成了光电定位和微流控技术、先进的自动化、培养、高分辨率成像能力和机器视觉算法，为研究人员提供全新的研究单细胞的方式。

单细胞光导系统MSC工作流程

使用OptoSelect® 1500芯片在Lightning™单细胞光导系统上对永生化MSC细胞系UE7T-13细胞进行克隆，在芯片上培养六天，然后针对CD73、CD90和CD105表面标志物进行染色。在芯片上进行表型和生长特征鉴定后，将单个克隆从芯片中导出到96孔板中（图1）。所有克隆在回收后都被继续培养，一部分通过其他测定法和基本关键质量属性（CQAs）进行评估，这些属性由国际细胞治疗学会（ISCT）确定用于定义MSCs [3]（具体实验方法参考完整应用手册）。

图1. MSCs筛选工作流程示意图。示意图展示利用Beacon®进行MSCs的克隆、培养、分析和导出后进行下游分析的流程。

实验结果

UE7T-13s是一种源自人骨髓的永生化MSC细胞系，被克隆并培养在三张OptoSelect® 1500芯片上。芯片用Adherent Cell Reagents Kit润洗，经过胰蛋白酶处理后的MSCs以2.5百万细胞/毫升的密度被导入芯片上。一旦进入芯片的通道，利用光电定位技术（OEP）以高精度将单个细胞移动到NanoPen小室中。平均每张芯片有1,079 ± 219个单个MSCs被成功分离并持续培养六天（图2）。

图2. 使用OptoSelect® 1500芯片分离和筛选838-1264个MSCs单细胞。

仅几个小时的培养后，就可以观察到MSCs已经粘附到芯片表面，并呈现出MSCs在2D组织培养处理表面上培养时的特征性扩展形态。经过六天的培养对细胞进行胰蛋白酶处理，并使用基于神经网络模型的定制细胞检测算法进行计数。平均芯片上克隆扩增的比例达到73.01 ± 6.88%（芯片上克隆扩增定义为用单个细胞加载的NanoPens中，继续扩增成由四个或更多细胞组成的克隆的百分比）（图3）。

图3 细胞扩增和倍增时间。芯片上培养的6天内，67-81%的单细胞形成了四个细胞以上的克隆群体。

在分离和扩增克隆MSCs期间，至关重要的是它们保留自我更新和分化的能力。为了确认在布鲁克单细胞光导系统上分离和培养的细胞保留了MSC表型，对六天后培养的克隆进行了CD73、CD90或CD105的染色。这三种表面标记已被ISCT认为是鉴定人类MSCs的基本标准[3]。大约96.3%的克隆为CD73阳性，96.6%为CD105阳性，95.2%为CD73阳性（图4）。

图4. 关键MSC表面标志物CD73、CD90和CD105在超过95%的单克隆中表达。

布鲁克的单细胞光导系统能力之一是能够在OptoSelect®芯片上培养和测定后回收单个克隆，可以根据克隆的扩增或者表面标志物回收特定克隆到96孔板的孔中。通过特殊的Bubble Dislodge方法，平均每个NanoPen中移出了7.4 ± 1.1个细胞，这约占每个小室中回收的总细胞数的59.3 ± 1.5%（图5）。导出后，MSC克隆在37°C和5% CO2条件下培养，在含有100微升细胞培养基的96孔板中培养大约14天，然后对每个孔进行成像以确定持续的扩增。研究发现，从单个小室回收到8个或更多细胞的孔扩增略好，有66.7%的孔在培养2周后达到至少25%的汇合度，而接收到2到7个细胞的孔这一比例为56%（图5）。

图5. a) 在MSC克隆导出不同阶段的NanoPen图像；b) 平均7.4 ± 1.1个细胞可成功从每个小室内导出到96孔板上；c) 平均56.3 ± 1.5% 在小室内扩增的克隆被成功导出；d) 导出细胞数量对导出后克隆扩增能力的影响。

限制间充质干细胞（MSCs）在临床应用中使用的一个主要挑战是它们在体外长期扩增过程中的衰老，这可能导致在次级培养过程中分化潜力的丧失[4]。为评估MSC克隆在经过处理并从布鲁克的单细胞光导系统导出后的克隆形成潜力和生长特性，进行了随时间的生长特性分析以及克隆形成测定（CFU-F），并将结果与由异质MSCs群体组成的对照亲本细胞系进行比较。生长特性分析显示，三个扩增克隆和对照亲本细胞系之间的累积细胞数量相似。每个克隆的平均CFU-F效率在35%到62%之间，而对照亲本细胞系的平均效率约为45%，这表明在OptoSelect®芯片上经历分离、培养和导出的MSC克隆保留了克隆形成能力（图6）。

图6. 克隆形成能力分析。在OptoSelect®芯片上导出并扩增后的三个克隆以及对照亲本细胞系的a) 累积细胞数量和b)平均CFU-F效率；c) 代表性图像显示了对照亲本细胞系和三个克隆的集落形成情况。

为了确保MSC表型得以保留，对三个扩增克隆进行了CD73、CD90和CD105表面标志物的染色。通过流式细胞分析，每个克隆中超过99%的细胞继续表达所有三个标记物，与亲本细胞系相似（表1）。

表1. ISCT表面标志物检测结果

为了进一步评估MSC的效力，三个克隆被置于特定的间充质谱系诱导条件下，进行28天的成骨分化和成脂分化。通过分化为成骨细胞（成骨谱系）的细胞外钙沉积的茜素红S染色强度，以及分化为脂肪细胞（脂肪谱系）的脂滴的油红O染色强度来验证每个克隆的MSCs（n=3）分化为两种谱系的能力（图8）。这些结果表明，在布鲁克单细胞光导系统上分离、培养和检测的单个MSC克隆保留了强大的多谱系分化能力。

图7. 多向分化能力。MSC克隆从单细胞光导系统导出后，分别进入成骨（茜素红S）或成脂分化（油红O）。图像显示了含有未诱导或诱导分化的细胞的孔板。

结论

在这篇应用说明中，我们展示了布鲁克单细胞光导系统用于MSC的单细胞分离、培养、分析和导出，并获取能够帮助我们更好理解MSC异质性及其对基于MSC的治疗产品的影响的关键表型和功能数据。从单细胞光导系统中导出的MSC克隆保留了MSC表型、克隆形成潜能和分化潜力。

参考文献

1. A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhjan, and K. S. Lalykina, Cell and Tissue Kinetics, vol. 3, no. 4, pp. 393–403, 1970.

2. Costa, Luis A., et al. Cellular and Molecular Life Sciences 78 (2021): 447-467.

3. Dominici, M. L. B. K., et al. Cytotherapy 8.4 (2006): 315-317.

4. Li, Yi, et al. International journal of molecular medicine 39.4 (2017): 775-782.