摘要：本文介绍了利用 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱系统、Agilent 1290 Infinity Ⅱ ELSD 检测器和 Agilent Poroshell 120 SB-C18, 3.0 mm × 150 mm, 2.7 μm 色谱柱对 PEG 偶联 重组蛋白注射剂中的吐温 20 进行定量分析的简单灵敏的方法。该方法采用含三氟yi酸 (0.1% TFA) 的乙腈和水溶液为流动相，以梯度条件对注射剂中吐温 20 进行分离分析。该 方法操作方便，灵敏度高，具有良好的线性关系、精密度和准确度，为生物制药企业测定 PEG 偶联的一类重组蛋白制剂中的吐温 20 辅料提供一种可选的解决方案。

前言：随着生物技术的高速发展，生物制剂研究着重应用于多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞 生长因子及单克隆抗体等领域。但是由于生物大分子具有天然的不稳定性，因此通常将吐 温等药用辅料添加到制剂中，以保证生物制剂的稳定性和安全性。

吐温 20（聚山梨酯 20，Tween 20）是一种非离子表面活性剂， 具有较强的亲水性和化学稳定性，对药物有较好的助溶作用，添 加到药物制剂中可提高其有效成分的溶解度。同时，吐温 20 能 够抑制大分子蛋白药物的自动聚合，提高蛋白药物的稳定性。 目前文献报道的吐温分析方法比较多，包括 HPLC-ELSD[1-2]、 HPLC-DAD[3]、HPLC-CAD[4] 和 LCMS[5] 等方法。在实际蛋白制剂中 的吐温分析中，这些分析方法由于受到不同蛋白药物的影响，各 有其优缺点。 本文建立了一种分析吐温 20 的 RP-HPLC-ELSD 方法，该方法在 直接进样 PEG 偶联的蛋白注射剂后，即可对其中的辅料吐温 20 进行准确的定量分析。

实验部分：试剂和样品 吐温 20 购自南京威尔药业股份有限公司（注射级）；聚乙二醇 (PEG，MW20000) 购自 JenKem Technology。三氟yi酸 (TFA) 为 HPLC 级，购自 DikmaPure 公司；乙腈为 HPLC 级，购自 J.T. Baker 公司（美国）。高纯水来自 Milli-Q 纯水系统（美国）现 制备。 含吐温 20 的 PEG 偶联重组蛋白注射剂、不含吐温 20 的阴性样品 和不含吐温 20 的空白辅料（含 PEG 等其它辅料）均由生物制药 厂家提供。 仪器和设备 采用最高耐压达 800 bar 的 Agilent 1260 Infinity II Prime 液相色谱 系统，由以下模块组成： – Agilent 1260 Infinity II Flexible Pump 四元梯度泵（部件号 G7104C） – Agilent 1260 Infinity II Multisampler 自动进样器（部件号 G7167A） – Agilent 1260 Infinity MCT 柱温箱（部件号 G7116A） – Agilent 1290 Infinity II ELSD 蒸发光散射检测器（部件号 G7102A） 利用 Agilent OpenLab CDS 2.4 软件进行仪器控制和数据分析。

RP-HPLC 色谱条件 色谱柱： Agilent Poroshell 120 SB-C18, 3.0 mm × 150 mm, 2.7 μm，部件号 683975-302 (T) 柱温： 50 °C 进样量： 10 μL 流速： 0.5 mL/min 检测器： ELSD 雾化温度： 50 °C 蒸发温度： 70 °C 气体流速： 1.80 SLM 流动相 A： 0.1% TFA 的水溶液 流动相 B： 0.08% TFA 的乙腈溶液 梯度程序： 时间 (min) B (%) 0 5 5 5 6 60 10 80 15 80 15.1 5 20 5 柱后阀切换： 0–7.5 min：1-2，至废液 7.5–9.5 min：1-6，至 ELSD 9.5–20 min：1-2，至废液

校准曲线绘制 利用浓度范围为 10–200 μg/mL 的 5 个吐温 20 校准标样，对各浓 度下的平均峰面积对分析物浓度作图，得到校准曲线。 样品前处理 方法一：取待测样品溶液（空白辅料、阴性样品或蛋白注射剂）， 过 0.22 μm 有机滤膜，直接进样分析。 方法二：取 1.0 mL 待测样品溶液到离心管中，加入 1.0 mL 乙腈 并混匀；静置一段时间后进行高速离心（13200 r/min，5 min）； 然后取上清液，过 0.22 μm 有机滤膜后进样分析。

结果与讨论：吐温 20 的 RP-LC 分析 比较了不同分离模式（SEC 和 RP）对 PEG 偶联重组蛋白注射剂 中吐温 20 的分离结果。 SEC 是分离蛋白溶液中辅料的常见方法。本实验中的蛋白分子 量比较小（19 kDa，PEG 修饰后为 39 kDa)，选择孔径为 130 Å 的色谱柱，并以乙腈和甲酸铵为流动相进行分析。吐温 20 在此 SEC 条件下色谱峰比较宽，灵敏度不高，且会受到前面蛋白色谱 峰和后面缓冲盐色谱峰的影响