摘要:合成或人工色素在食品和饮料中作为添加剂，可以改善产品的外观。在本研究中，我们开发了一种稳定的反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 方法，实现了 10 种合成色素的同时测定。采用配有 Agilent Poroshell EC-C18 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 液相色谱系统实现分离和定量分析。通过部分验证确定了方法的稳定性。通过分析糖果中的色素添加剂，证明了该方法定量分析食品基质中人工色素的适用性。最后，将 HPLC 方法有效转换为一个耗时短的超高压液相色谱 (UHPLC) 方法，采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统，实现更快速的分析，且不损失分离度。采用 Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器 (DAD)，可以选择不同的波长，实现在不同色素各自的最大吸收波长处进行定量测定。采用两种方法，分别确定了每种色素的检测限 (LOD)、定量限 (LOQ)、精密度、准确度和线性。在分析工作流程中采用 Agilent 7696A 样品制备工作台，帮助在LOD、LOQ 和线性研究中进行样品前处理。

前言色素添加剂是指加入食品中使其带颜色的任何染料、色素或物质1。当前有主要来源于植物或动物的天然和合成色素添加剂。如：姜黄和藏红花。合成色素是化学合成的色素，如酒石黄和靛胭脂2。在食品中加入色素有许多原因。其中包括补偿因长期储存出现的褪色、纠正颜色的自然变化，以及使无色食品着色等。实际上，色素添加剂是市场上大多数包装食品不可避免的一类成分1。研究业已证明，人工色素暴露量超出每日摄入*将会导致儿童产生多动症和其他不安行为3。美国食品药品监督管理局 (FDA) 已经制定了相关条例，旨在控制和确保食品中仅含有允许使用的色素添加剂。这就强调了使用精确的分析技术对色素进行鉴别和定量分析的重要性。在本文中，我们采用 Agilent Poroshell120 EC-C18 色谱柱，开发了一个反相高压液相色谱方法。食品色素的水溶性使反相 HPLC 成为分析这些物质的理想技术。

方法仪器与软件Agilent 1260 Infinity 四元液相色谱系统包括如下模块：• Agilent 1260 Infinity 四元泵和真空脱气机 (G1311B)• Agilent 1260 Infinity 高效自动进样器(G1367E)• Agilent 1260 Infinity 柱温箱 (G1316A)• 带最大光强流通池（60 mm 光程）(G4212-60007) 的 Agilent 1260Infinity 二极管阵列检测器 (G4212B)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱，4.6 x 150 mm，2.7 µm (693975 902)开发和运行 UHPLC 分析所使用的 Agilent1290 Infinity 液相色谱系统包括：• 集成了真空脱气机 (G4220A) 和 100 µLJet Weaver 混合器的 Agilent 1290Infinity 二元泵• Agilent 1290 Infinity 高效自动进样器(G4226A)• Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C)• 带最大光强流通池（1.0 µL 扩散体积，10 mm 光程）(G4212-60008) 的 Agilent1290 Infinity 二极管阵列检测器 (G4212A)• Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱，内径 2.1 mm，柱长 75 mm，采用 2.7 µm颗粒填充 (697775-902)两套系统均采用安捷伦化学工作站（B.04.02 版）进行控制。系列线性浓度稀释样品采用 Agilent 7696A样品制备工作台制备。

试剂与材料所有化学品和溶剂均为 HPLC 级，高纯水使用 Milli Q 水纯化系统（Millipore Elix10 型，美国）制备。甲醇为超梯度级，购自 Lab-Scan 公司（泰国曼谷）。磷酸氢二钠和正磷酸购自 Fluka 公司（德国）。二甲基亚砜 (DMSO) 购自 Qualigens 公司（印度）。酒石黄、苋菜红、靛胭脂、胭脂红 4R、日落黄 FCF、红色酸性染料、固绿 FCF、酸性蓝/亮蓝、胭脂红 3R，以及赤藓红 B 标准品购自 Aldrich 公司（印度）。用于回收率和定量分析的糖果购自本地。

色谱参数反相液相色谱和 UHPLC 中使用的色谱参数见表 1。

色素标准溶液称取各标准品约 20 mg，分置于 10 mL 容量瓶中，分别制备酒石黄、苋菜红、靛胭脂、胭脂红 4R、日落黄 FCF、红色酸性染料、固绿 FCF、酸性蓝/亮蓝、胭脂红 3R，以及赤藓红 B 的标准储备液。于每个容量瓶中加入 300 µL DMSO，将流动相 A 和 B 按照 80:20 的比例预混合的溶液作为稀释剂。需要时超声处理。混合标准溶液和线性浓度精确量取各标准溶液约 100 µL 并混合，加入稀释剂至 2000 µL，得到每种色素浓度均为 200 ppm 的色素标准混合溶液。使用 Agilent 7696A 样品制备工作台连续稀释该 200 ppm 标准混合溶液，制备系列线性浓度的标准溶液。线性标准溶液的浓度范围为 0.01 ng/µL – 200 ng/µL（10 个浓度水平及各重复 6 次）。

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用于色素定量分析和回收率研究的样品前处理使用不同类型的样品（即包含不同色素的糖果）进行色素定量分析和回收率研究。依次向 2 g 糖果中加入 400 µL DMSO 和20 mL 稀释剂，提取其中的色素，过程非常简单。超声处理并采用带有 C0650转子的 Beckman Coulter Allegra X22R 离心系统，以 8300 rcf 的离心力离心 10 min后，溶液通过 0.25 µm PTFE AgilentEconofilter 注射式过滤器滤膜过滤，滤液待分析。使用加标和不加标的糖果样品进行回收率研究。样品加标采用柱上浓度为 25 ng 的标准混合溶液。提取过程如前所述。

预防措施为了延长化合物在溶液中的稳定性，不使用时，所有制备的溶液用铝箔包裹，并于冰箱暗处 4 °C 贮存。分析期间，可恒温的自动进样器样品盘保持在 5 °C。步骤表 2 所示的系列浓度校准溶液是采用稀释剂系列稀释 200 ng/µL 标准混合溶液而得。在两个系列溶液的配制中，采用带500 µL 注射器的 Agilent 7696A 样品制备工作台来配制线性浓度的溶液。在第一序列，向每个样品瓶中加入一定量的稀释剂；在第二序列，将 250 µL 200 ng/µL的溶液加入样品瓶并涡旋 15 s。注意,除了分别运行这两个序列外，这些步骤也可以在一个方法中编程并在一个序列中运行。取上一个浓度的溶液 250/100 µL置于下一个浓度的样品瓶中进行系列稀释。Agilent 7696A 样品制备工作台设置的注射器参数见表 3。Agilent 7696A 样品制备工作台4 的设置在安捷伦应用简报（出版号 5990 6850CHCN）中有详细描述。进样分析 5 µL 含有 DMSO 的稀释液作为空白，然后依次进样分析系列浓度的各校准溶液，每个浓度平行分析 6 次。用每个浓度的峰面积和保留时间 (RT) 数据来计算标准偏差 (SD) 和相对标准偏差 (RSD)值。并以较低线性浓度溶液的进样分析确定 LOD 和 LOQ。以各色素每个线性浓度峰面积的平均值对其相应浓度作图，构建线性曲线。

通过改变 6 个关键的方法参数来评估方法的稳定性。平行 6 次进样分析含每种色素各约 30 ng（柱上量）的标准混合溶液，利用获得的数据来研究方法的稳定性。分别进样分析 2 g 糖果中加标 25 ng 色素添加剂标准品和不加标的样品溶液，来研究方法的回收率。利用所有 10 种色素标准品的特征图谱建立其 UV 谱库。连同保留时间，该谱库可用来鉴定糖果中的色素添加剂。该方法可有效转换到 UHPLC。评价了每种色素的 LOD、LOQ 和线性，方法精密度通过峰面积和 RT 的 RSD 来确定。同时还绘制了所有色素使用 UHPLC 方法的线性曲线。UHPLC 方法可使分析更快速，并且不损失分离度

结果与讨论分离与检测采用 Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm x 4.6 mm，2.7 µm）色谱柱，这 10 种色素在 20 min 内实现了良好分离。不同的色素具有不同的最大吸收波长。这 10 种色素的色谱流出曲线见图 1，色素列表及其各自的最大吸收波长见表 4。我们使用化学工作站软件中的峰纯度功能检查各色谱峰的纯度，从而评价了方法的专属性。通过对精密度、线性范围、准确度、专属性、回收率和稳定性进行研究来验证本方法。

检测限 (LOD) 与定量限 (LOQ)信噪比 (S/N) > 3 时的分析物浓度定义为LOD，S/N > 10 时的分析物浓度定义为LOQ。测得的每种色素的 LOD 和 LOQ 值见表 5。作为一个实例，图 2 展示了胭脂红 4R LOQ 浓度（柱上量 0.1 ng）时与空白的叠加色谱图。

线性所有制备的线性浓度溶液平行进样分析6 次，利用峰面积响应及其相应的浓度值来构建每种色素从 LOQ 浓度到最高浓度的线性曲线。获得的所有色素的相关系数