摘要：双酚 A 可以从食品容器的塑料表面浸出，在多种基质如血浆、尿液和地下水中均被检出。它是一种内分泌干扰物，能够模拟婴儿自身的激素（如雌激素），可能会对健康产生不良影响。本应用简报将介绍一种婴儿奶瓶中提取的双酚 A 及其结构类似物双酚 F 的定量方法。我们使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱，在 Agilent 1260 Infinity 液相色谱仪上开发了此方法。通过部分方法验证以确证方法的线性、稳定性及峰面积和保留时间的精密度。使用 Agilent 7696A 样品制备工作台自动进行系列稀释，可节省分析时间。结果表明，双酚 A 的定量限 (LOQ) 为 1.06 ng/mL。样品回收率研究表明，所得双酚 A的回收率为 80%。利用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统将本方法转移至超高效液相色谱 (UHPLC)。UHPLC 方法所采用的实验条件相同，色谱峰更窄更高，分离度更好，并且信噪比也有所改善。这两种方法均可应用于双酚 A 的定量分析，实现食品容器（例如，婴儿奶瓶）的质量控制。

前言双酚 A (BPA) 是一种用于制造聚碳酸酯塑料和环氧树脂的单体。在不同环境条件下，如受热或改变 pH，痕量 BPA 能够从聚碳酸酯塑料表面浸出，最终进入到人体中。BPA 在诸如尿液、地下水和血浆等不同基质中被检出。基于在阈值以上可观察到毒性作用的假设，美国国家环境保护局 (USEPA) 规定每人每天的 BPA 参考剂量 (RfD)为 50 µg/kg.bw1。使用聚碳酸酯塑料制造的奶瓶对儿童具有潜在的风险。在本应用简报中，我们使用市售的结构类似的化合物双酚 F (BPF)（图 1）与 BPA 一同分析以确定分离效率。Ballesteros-Gomez 等人对用于分离、鉴别和定量 BPA 的分析方法进行了综述2。此外，ASTM 标准检测方法 D 7574-09 利用离线 SPE 法从环境水样中提取双酚 A3。BPA 是一种荧光化合物，荧光检测器 (FLD)可以灵敏地测定奶瓶浸出的 BPA 浓度。本应用简报介绍了一种结合离线 SPE 和 (U)HPLC/FLD 对 BPA 和 BPF 同时定量分析的方法。

实验部分仪器和软件Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统，包括以下模块：• Agilent 1260 Infinity 二元泵 (G1312B)• Agilent 1260 Infinity 自动进样器和恒温器 (G1367E, G1330B)• Agilent 1260 Infinity 柱温箱 (TCC)(G1316A)• Agilent 1260 Infinity 荧光检测器(G1312B)，配有 8 µL 流通池UHPLC 分析由 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统实现，该系统包括如下模块：• Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A)• Agilent 1290 Infinity 自动进样器和恒温器 (G4226A, G1330B)• Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C)• Agilent 1260 Infinity 荧光检测器(G1312B)，配有 8 µL 流通池软件：• 安捷伦化学工作站 B.04.02样品前处理：• Agilent 7696A 样品制备工作台

试剂与材料使用的所有化学品和试剂均为 HPLC 级。所用纯净水来自 Milli Q 水纯化系统（Millipore Q-POD Element，美国）。超梯度级乙腈和甲醇购自 Lab-Scan（泰国曼谷）。磷酸氢二钾购自 Fluka（德国）。双酚 A 和双酚 F 标准品购自 SigmaAldrich（印度）。购买的不含 BPA 的奶瓶为美国制造，另外三个不同品牌的聚碳酸酯奶瓶为本地生产。

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步骤在确立线性范围之前，将奶瓶提取物的复溶溶液进行进样分析以测定 BPA 的近似浓度。首先注入 20 µL 流动相 A 作为空白，然后平行测定 6 次各线性浓度样品。各浓度下的峰面积和保留时间 (RT) 数据用于计算相对标准偏差值 (RSD)。将在线性范围之内的各浓度下的平均峰面积针对浓度作图得出校准曲线。以较低线性浓度溶液的进样分析确定 BPA 和 BPF 的检测限(LOD) 和定量限 (LOQ)。为了评估方法的稳定性，对方法的 6 个关键参数进行了考察：• 流速 ±2%• 柱温 ±2.5%• 进样量 ±5%• 激发和发射波长 ±3%• 阶梯梯度 ±10%• 缓冲液浓度 ±10%对于稳定性考察的每个参数，重复 7 次分析浓度为 30 ng/mL 的 BPA 和 BPF 标准溶液。为进行回收率研究，我们按照图 2 所述从不含 BPA 的奶瓶中提取样品。向 50 mL此样品中加入低浓度或更高浓度的 BPA 和BPF。将加标样品进行 SPE 处理，再利用校准曲线测定所得样品的浓度，然后，将理论浓度与实测浓度值相比得出回收率。

最后，使用标准 HPLC 方法分析 3 个不同品牌的奶瓶，测定两种双酚的浸出浓度。然后，将方法转移至 Agilent 1290 Infinity液相色谱系统，使用相同的实验条件在1.8 µm 色谱柱上进行分析，测试方法的分离度和灵敏度。对该方法各标准品的 LOD、LOQ、线性也进行了评估，并利用峰面积和 RT RSD 考察了方法的精密度。

结果与讨论分离和检测在方法开发过程中，使用酸性和碱性流动相在 C18 柱上测试 BPA 和 BPF 的分离情况。此外，在确定最终方法之前，还对从奶瓶提取的水样进行了检测。使用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱作进一步实验研究。TCC 在较低温度(35 °C) 时，BPA 与相邻洗脱的杂质达到最佳分离，但是在分析基质样品时发现TCC 为 40 °C 时更有利。采用线性梯度可将两种双酚分离，但是，初步的方法稳定性研究表明，对梯度进行修改后，分离度会出现较大的变化。因此采用阶梯梯度方法，该方法可获得相对稳定的结果。ASTM 方法建议低温保存双酚，因此，在分析过程中自动进样器温度保持在 4 °C。图 3 显示了使用最终方法分离两种双酚所得的色谱图。

检测限 (LOD) 与定量限 (LOQ)信噪比 (S/N) >3 时的分析物浓度定义为LOD，S/N>10 时的分析物浓度定义为LOQ。使用峰间比值法计算噪音。图 4 显示了 LOQ 浓度的 BPA 与空白（流动相）进样的叠加色谱图。对于 BPA，LOD 为0.19 ng/m，S/N 为 4.3；LOQ 为1.06 ng/mL，S/N 为 15.1。