白酒香气物质研究的方法学
时间：2020-03-11 阅读：7418
摘自《食品科学技术学报》
范文来，男，研究员，主要从事酿酒工程与发酵工程方面的研究。
我国白酒风味物质研究始于1964年茅台酒的第2次试点。1964年10月采用纸上层析法研究酱香型白酒窖底香气微量成分，当时一个斑点呈现窖底香，经鉴定是己酸乙酯，并进行了添加实验确认。1955年di一台商业化气相色谱(gas chromatography，GC)出现，1967年将GC应用于我国白酒微量成分研究 。1964年Fuller等发明了气相色谱-闻香技术(GC-olfactometry)，将GC的化合物分离性能与人的鼻子闻香结合起来，从此，食品风味研究取得了突飞猛进的发展。但直到2005年GC-O技术才应用于我国白酒风味研究。笔者曾经对风味研究方法及香气物质研究有过回顾，江南大学生物工程学院酿造微生物学及应用酶学研究室的范文来， 徐岩拟回顾GC-O技术应用于白酒研究的方法学，包括总体研究思路、闻香技术、香气成分定量技术以及香气重组与缺失技术，以期对酒类香气成分研究有所启发。
1 白酒香气总体研究思路
白酒香气研究的方法与食品风味研究方法[11-12]类似，但又有其自身特点。主要包括以下几个主要方面。
一是香气物质提取。香气物质提取方法目前主要使用的还是经典的液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)方法，白酒中大部分香气物质是极性较强的化合物，因而常用萃取剂是乙mi、二氯甲烷、氟利昂或它们的混合物[13-21]，当然也有使用顶空固相微萃取(head-space solid phase microextraction，HS-SPME)作为样品提取的方法[6]，但由于该方法在萃取物极性方面上的局限，因而较少使用。
白酒LLE的关键是酒精对萃取物的影响。研究表明，高度白酒必须稀释后才能有效萃取，稀释后的酒精度是10%vol～14%vol[6,13-14,18]。
为防止水可能带入的气味物，风味研究全过程使用的水为超纯水(Milli-Q)，且将水加热煮沸5 min，冷却后使用。
为防止洗涤剂带入的气味物，必须使用无味洗涤剂浸泡实验用玻璃器皿1～2d，再按常规方法清洗。清洗后的玻璃器皿再用煮沸冷却后的超纯水洗涤3次，进行烘干，不能高温烘干的材料，常温晾干。
二是香气物质分离。白酒微量成分含量十分丰富，多达千种[22-23]，已经鉴定出的化合物达698种[23-24]。在闻香过程中，可能会出现化合物GC峰重叠，造成香气重叠；或某些化合物香气太强，而掩盖了香气较弱的化合物。因此，通常会将萃取后的有机相再进行分离，或称为分馏(fractionation)。如将萃取后的有机相分为酸性组分(acidic fraction，AF)、碱性组分(basic fraction，BF)、水溶性组分(water-soluble fraction，WSF)和中性组分(neutral fraction，NF)[17-18]，或分为AF、WSF、中碱性组分(N/BF)[16,21]，或分为酸性-水溶性组分(A/WF)和N/BF[13-14,19-20,25-27]。但由于中性组分或中碱性组分仍然比较复杂，即化合物众多，此时，还可以采用正相色谱技术(normal-phase liquid chromatography，NPLC)，根据化合物极性将其再细分为多个亚组分(subfraction)[13,18]。如在洋河大曲研究时，N/BF组分化合物多，采用硅胶60(silica gel 60)吸附N/BF组分香气成分，分别使用V(戊烷)∶V(乙mi)=98∶2、95∶5、90∶10和0∶100混合液洗脱成4个组分[13]。在进行茅台酒和郎酒研究时，分别使用V(戊烷)∶V(乙mi)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30和0∶100混合液洗脱成6个组分[18]。在研究药香型白酒香气和萜烯类化合物时，将N/BF组分使用硅胶柱分别用V(戊烷)∶V(乙mi)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50和0∶100混合液洗脱出7个组分[19,28]。如此形成的AF或A/WF、BF、NF或N/BF、水溶性组分，或者加上NPLC的亚组分分别进行闻香。
三是活性香气化合物(active-aroma compounds)发现。一个特定酒样中，什么技术可以检测哪一个化合物对香气有贡献呢？通常认为是GC-O技术[5]，又分为精灵分析(CharmAnalysis)法[29]、香气萃取稀释分析(aroma extract dilution analysis，AEDA)法[12,30]、香气萃取浓缩分析(aroma extract concentration analysis，AECA)法[31]、Osme技术(Osme techniques)[32]等。这些技术能检测到可能呈香的化合物，再与GC-氢火焰离子化检测器(GC-flame ionization detector，GC-FID)或GC-质谱检测器(GC-mass spectrometry，GC-MS)技术结合后，就可以进行香气化合物鉴定。
香气化合物的鉴定需要使用标准品进行确认，即当未知化合物香气特征、色谱保留时间(retention index，RI)[33]以及质谱信息与标准品*一致时，即可确认。通常情况下，需要使用二个极性不同的色谱柱(如极性和非极性色谱柱)进行确认[13-14,34-35]。
四是重要活性香气化合物确认。应用Charm-Analysis、AEDA和Osme技术能够发现重要的风味化合物，但由于检测到的这些化合物呈现的是在空气中的香气强度，与原白酒样品中实际香气强度有区别，因此，通常使用气味活力值(odor activity value，OAV)的大小来表征其重要程度。OAV是指气味化合物浓度与其对应介质中气味阈值的比值[12,36]。OAV越大，说明该香气化合物越重要[37-39]。化合物浓度的测定在本文第3节香气成分定量技术部分讨论。
为此，需要测定这些香气化合物在白酒中的气味阈值。*大规模测定白酒香气化合物阈值文章发表于2011年，当时组织国家ji评酒员测定了79个香气化合物在φ=46%酒精水溶液中的气味阈值[40]，其后，不少研究人员又陆续测定了一些化合物的阈值。到目前为止，据不*统计共测定了143种化合物气味阈值，包括32种酯类、15种醇类、15种醛类、2种缩醛、5种酮类、14种脂肪酸、9种吡嗪、7种呋喃类、16种芳香族、14种酚类、4种内酯、6种含硫化合物和4种萜烯类化合物的阈值[25, 35, 40-43]。
五是关键香气化合物确认。OAV大的化合物是不是关键香气需要进行验证。其一是选择一些OAV较高的化合物，进行香气重组(recombination)或香气重构(reconstitution)，建立香气模型。如果重组后的整体香气与原有酒样不一样，或相似度不高，则需要从香气物质提取开始重新实验；其二是通过缺失实(omission test)，确定关键风味成分。如果缺失某个化合物后，整体香气与原有研究酒的香气不同，则该化合物为关键香气化合物[34-35, 44] 。
2 闻香技术
无论采用何种闻香技术，参加闻香的人员必须进行培训与选择[6,34]。AEDA闻香时通常需要2～3人，每个稀释度闻香6次(每人2～3次)，只要有1人闻到香气就认可这个香气存在，计算其香气稀释因子(flavor dilution factor，FD值)[14,34-35]。而Osme技术中，主要使用香气强度。香气强度通常有6点刻度法(0～5)[45]和16点刻度法(0～15)[13]。“0”表示没有香气；中间点“3”或“8”表示香气强度中等；“5”或“15”表示香气zui强[13,45] 。
2.1 AEDA法
AEDA方法由Grosch于1993年发明[12,30]。萃取浓缩后的样品与溶按V∶V=1∶1、1∶2、1∶3比例稀释，每一个稀释样品用GC-O闻香[11]，结果用FD值表示。FD值是指初萃取物中呈香物质浓度与该香味物质稀时(GC-O仍能检测到)浓度比。因此，FD值是一个相对测量值，是化合物在空气中的OAV值。AEDA法已经在酒类风味研究领域得到广泛应用，如豉香型白酒香气研究[34]、洋河大曲新酒与老酒香气研究[6]、五粮液与剑南春香气研究[14]、清香型原酒香气研究[20] 。
2.2 Osme技术
Osme一词来源于希腊语，意思为“闻香(smell)”。Osme技术由McDaniel等人开发[32]。该方法是萃取获得的样品，不经稀释，直接进行GC-O分析，记录香气强度。将感官品尝人员记录到的香气强度进行平均，即为香气强度值，此法又称为GC-香气强度法(GC-intensity)。Osme技术考虑了斯蒂文斯法则(Stevens’s Law)[3]，它测量的是香气物质的时间-强度值(time-intensity)。该技术因耗时短，已经在白酒香气研究中获得广泛应用，如洋河大曲香气研究[13]、洋河绵柔型白酒香气研究[27]、清香型白酒(包括汾酒、宝丰酒和青稞酒)香气研究[35]、茅台与郎酒香气研究[18]、酱香型习酒和浓香型习酒香气研究[25, 46]、老白干香型白酒香气研究[16]、牛栏山二锅头香气研究[26]、宝丰酒香气研究[47]、药香型董酒香气研究[19]、豉香型白酒香气研究[48]、兼香型白酒香气研究[17]、白酒异嗅物研究[21]。
3 香气成分定量技术
精确定量白酒中香气成分是件十分困难的事。白酒中香气成分众多，化学性质不一；浓度千差万别，从ng/L至g/L。因此，对白酒化合物定量通常需要几个方法结合使用。对浓度较高的化合物，如己酸乙酯(浓香型等香型)、乙酸乙酯、乳酸乙酯等(几百mg/L至g/L)，通常采用直接进样GC-FID测定[25]；而对于浓度较低的化合物(μg/L至几十mg/L)，通常采用HS-SPME[25]或搅拌子吸附萃取技术(stir bar sorptive extraction，SBSE)测定[49]。而对于一些特殊化合物如含氮化合物，则采用检测器氮磷检测器(NPD)测定[50]；另外一些化合物如反-2-烯醛类化合物需要衍生化后测定[34]。
3.1 直接进样GC-FID
白酒中一些高浓度香气化合物可以采用此法测定，主要包括浓香型和酱香型白酒中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、正丁醇、2-甲基丙醇(异丁醇)、3-甲基丁醇(异戊醇)[25]；清香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯[35]；豉香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇和2-苯乙醇[34]；芝麻香型白酒中的乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇和乙缩醛[39]。因测定的化合物大部分为酯类，故采用乙酸戊酯作内标[25,34-35]。该法还可以直接定量白酒中的乙醛与乙缩醛，此时使用辛醛-d16作内标[51]。
另外一些化合物也可以采用GC-FID检测，如乙醛和乙缩醛，此时可用辛醛-d16作内标[51]。
3.2 LLE和液液微萃取
LLE与GC-MS结合后可用于化合物定量分析，如地衣芽孢杆菌发酵液成分检测[52]，高浓度硫化物检测等[53]。
液液微萃取(liquid-liquid microextraction，LLME)是一种环境友好的技术[54]。LLME结合GC-MS采用选择离子法(selective ion monitoring，SIM)通常定量mg/L级化合物[25,55]。该法在酱香型白酒中可一次性定量48种香气化合物，包括酯类13种、醇类11种、酸类9种、芳香族化合物9种、呋喃类化合物4种、醛酮类1种以及吡嗪类化合物1种。乙酸乙酯、乙缩醛、丙酸乙酯因溶剂延迟无法定性与定量；乙醛因挥发性太强，无法使用LLME方法定量[55]。该法目前已经广泛应用于白酒定量中，如酱香型[25,55]、浓香型[25]、清香型[35]、芝麻香型[56]白酒。另外，因SPME萃取头对脂肪酸不敏感，故脂肪酸类化合物可以采用LLME法测定[39]。
3.3 SPME结合GC-MS
SPME技术于1989年由Belardi和Pawliszyn[57]开发，已经被广泛用于食品风味物质研究[58]，主要用于定量μg/L级化合物。该技术可用于以下分析：一种是顶空分析，即HS-SPME，2005年HS-SPME*应用于白酒风味研究[6]，后该技术结合GC-MS在我国白酒风味研究中获得广泛应用，如酱香型[18,25]、浓香型[25]、豉香型[34]、芝麻香型[39,59]白酒风味研究；白酒中异嗅物分析[21,60]。
另外一种是浸入式SPME技术(direct immersion-SPME，DI-SPME)。2007年DI-SPME技术应用于我国白酒风味成分定量[61]，后又应用于白酒中异嗅化合物[62]、游离挥发性酚类[63]以及挥发性香气物质[64]定量。
3.4 SBSE结合GC-MS
SBSE技术由比利时色谱研究所Baltussen和Sandra等[65-66]于1999年开发，与其类似的技术搅拌子顶空吸附萃取技术(headspace sorptive extraction，HSSE)则由Bicchi和Tienpont等[67-68]首先应用。SBSE技术已经广泛应用于食品分析中[69-73]。2011年，这一技术被用于酱香型茅台与郎酒的香气成分分析[49]，一次可以定量76个挥发性成分，包括25种酯、10种醇、9种醛和酮、8种芳香族、5种呋喃、3种含氮化合物、6种脂肪酸、4种酚类、3种萜烯、1种含硫化合物、1种内酯和1种缩醛。
3.5 固相萃取结合GC-MS
固相萃取(solid phase extraction，SPE)己被*为是一个非常有用的样品预处理技术，已经广泛应用于饮料酒成分分析中，如葡萄酒、威士忌、白兰地[74] 以及结合态风味化合物 [75-76] 研究中。SPE可以用于白酒香气成分预处理，即选择某一吸附材料，吸附白酒香气物质，再洗脱、浓缩后用于GC-O分析 [77] ；SPE结合GC-MS技术可以定量白酒中香气物质如定量8种内酯 [78] ，包括γ-丁内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、γ-庚内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、γ-癸内酯、γ-十二内酯；或定量白酒中其他风味物质 [79] 。
3.6 检测器测定技术
白酒中含氮、硫化合物，因FID或MS检测器响应不灵敏，需要使用检测器进行定性和定量。
氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)可用于检测白酒中吡嗪类化合物[50]。NPD俗称碱火焰离子化检测器(alkali flame ionization detector，AFID)、热离子离子化检测器(thermionic ionization detector，TID)、火焰热离子化检测器(flame thermionic detector，FTD)、热离子化检测器(thermionic specific detector，TSD)，于1964年被Karmen和Giuffrida发明[80]。应用GC-NPD并结合GC-MS，可以定性白酒中26种吡嗪类化合物，在有标准品的情况下能用于定量分析[50]。
火焰光度检测器(flame photometric detector，FPD)是在FID基础上于1966年发明的[80]，目前已经发展成为脉冲火焰光度检测器(pulsed flame photometric detector，PFPD)。GC-FPD/PFPD已经用于白酒硫化物检测[59,81-82]，如GC-FPD可以测定白酒中近20种硫化物[81]。GC-PFPD可以检测茅台酒中13种硫化物[82]。
3.7 衍生化测定技术
不饱和醛如反-2-烯醛和二烯醛是豉香型白酒重要香气成分[34]，由于这些化合物含量低，常规方法无法检测，因此，需要衍生化后进行检测。使用O-(2,3,4,5,6-五氟苯)羟胺盐酸盐(O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride，PFBHA)作为衍生化试剂，p-氟苯甲quan作内标(p-fluorobenzaldehyde)，HS-SPME结合GC-MS同时萃取衍生化可测定反-2-戊、己、庚、辛、壬烯醛、反,反-2,4-己二烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-辛二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、反,顺-2,6-壬二烯醛等[83]。
当然，由于羰基会与PFBHA反应，故该衍生化方法能定性白酒中53种羰基化合物，可定量除乙醛和丙酮外的51种羰基化合物，包括11种直链饱和脂肪醛、3种支链饱和脂肪醛、14种不饱和脂肪醛、8种饱和脂肪酮、6种芳香族羰基化合物、4种呋喃类羰基化合物以及5种其他羰基化合物[84-85]。与常规 HS-SPME定量方法相比，多定量43种化合物，检测限低达到0.01μg/L，即10ng/L(反-2-庚烯醛)[85]。
3.8 全二维气相色谱-飞行时间质谱技术
全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensive two-GC-time of flight-MS，GC×GC-TOF-MS)于1985年由Phillips等[86-87]发明。这一技术解决了一维GC不能将众多化合物分离的问题。目前这一技术已经在白酒硫化物[88]、白酒风味成分[89]研究等方面得到应用。
4 香气重组与缺失技术
定量了活性香气化合物浓度，测定它们在φ=46%酒精水溶液中的嗅阈值，则可以计算出OAV值。将计算后的OAV值从大到小排序。在白酒香气重组时，通常忽略OAV小于1的化合物，而使用OAV大于1的化合物进行香气重组，如豉香型白酒香气研究中，共检测到56个活性香气成分，但仅采用34个OAV大于1的化合物进行重组[34]；在清香型汾酒香气研究中，共检测到66个活性香气成分，仅采用27个OAV大于1的化合物进行香气重组[35]；在浓香型剑南春酒香气研究中，共检测到126个活性香气成分[14]，后选取40个化合物进行香气重组[44] 。
当重组后的φ=46%酒精水溶液香气与初的样品香气相似时，即可认为香气重组成功，此时，可进行缺失实验。缺失实验是将用于重组的化合物逐一省略，重组出少一个化合物的新样品，并逐一进行闻香判别。当某一化合物缺失后，重组样品的香气与原酒样差距大或有显著性差异时，即可认为该化合物是关键香气化合物[12] 。
然而，由于白酒重组香气成分较多，逐一缺失时，会造成工作量特别是闻香工作量太大。故通常选择缺少一类化合物如酯类或醇类化合物。如果某类化合物缺失后，造成重组样品香气与原有酒样香气显著不同，则在此类化合物中再逐一缺失[34-35,44]。
5 研究展望
目前，大部分香型白酒的活性香气成分已经得到广泛研究，但能够香气重组的香型并不多。或许，在样品预处理上仍然存在一些缺陷；或没有提取或分离出应该提取或分离的香气成分；或在GC-O阶段，某个香气组分的香气被其它成分所掩盖；或者这个香气成分处于闻香的后段，即化合物的RI值较高，且化合物不出峰，造成无法鉴定；或者这个香型的关键香气是几种香气化合物协同作用的结果。要解决这些问题，需要开发一些新的研究策略来研究这些白酒的活性香气成分。但不管如何，后仍然需要定量、阈值测定、计算OAV，并进行香气重组与缺失试验。
参考文献：略（可点击原文查看）
范文来，徐岩.白酒香气物质研究的方法学[J]. 食品科学技术学报，2018,36(3):1-10.
FAN Wenlai,XU Yan. Methodology for aroma compounds in Baijiu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018,36(3):1-10.
基金项目：“十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0400503)。