摘要：目的探讨大豆肽（soybean peptide, SP)通过下调Notch 1信号通路防治哮喘大鼠气道炎症反应的作用机制。方 法将60只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松（Dexametha_Sone,Dex)0.5mg/kg组及大豆肽 600、300 及 150 mg/kg 剂量组。采用卵清蛋白（Ovalbumin, OVA) + 氨氣化f吕（Aluminum hydroxide, Al (OH) ₃)法复制大 鼠哮喘动物模型，同时给予相应剂量的大豆肽进行干预，每天给药1次，连续7 d。末次给药24 h后收集大鼠肺泡灌洗 ye（broncho - alveolar lavge fluid, BALF),进行白细胞分类计数；取大鼠右下叶肺组织常规HE染色，观察肺组织病理学 改变及气道重塑变化；采用逆转录PCR和Western - blot法检测大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB mRNA 和蛋白表达水平。结果与哮喘模型组比较，大豆肽600 mg/kg剂量组大鼠BALF中的中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸 性粒细胞计数显著降低（P <0.01);大鼠肺组织病理损伤较模型组明显改善，炎性细胞浸润明显减少；大鼠肺组织 Notch 1、agged 1、Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表达水平明显下调（P <0. 05,P <0. 01)。结论大豆肽对哮喘大鼠 炎症反应具有防治作用，其机制与下调Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF-kB信号通路有关。

关键词：大豆肽；哮喘;Notch 1;炎症

支气管哮喘（bronchial asthma, BA)简称“哮喘” 是一种常见的呼吸系统炎症性病症，往往伴有巨噬细

作者简介:张玲（1981 -),女，本科，讲师，研究方向：呼吸系统疾病防治 通讯作者：徐松涛，E - mail:375874072@ qq. com 胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞及中性粒细胞 等炎性细胞浸润和气道上皮细胞损伤，出现气道平滑 肌痉挛，表现为喘息、呼吸困难、气急、剧烈咳嗽等哮 喘症状¹。Notch 1信号通路是调控细胞分化、迁移、 凋亡、增殖、炎症及肿瘤发生等生理病理过程的重要 信号分子¹²。研究报道，Notch 1信号通路激活后可 诱导气道成纤维细胞分化和增殖，促使气管重塑，引
发免疫系统紊乱,诱导炎症反应，从而引发和促进支 气管哮喘的发生发展。大豆肽（soybean peptide, SP)是大豆经过酶解或微生物发酵分离提取得到的多 肽混合物，具有免疫调节、抗氧化、缓解疲劳等作 用。本研究观察了大豆肽对哮喘大鼠的防治作 用，并以Notch 1信号通路为研究对象探讨其抗炎平 喘分子机制。

1材料与方法

1.1实验动物SD大鼠（SPF级），雄性,w龄，体 重180 ~200 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司， 许可证号：SCXK (湘）2011 -0003。将大鼠适应性饲 养5d,每笼4 ~5只,3 ~4d更换1次垫料,调整室 内温度为 22 ±2°C,湿度为 45% ~ 65%, 12 h/12 h 光照周期，常规饮食水。

1.2主要试剂大豆肽，河南省南街村（集团）有限 公司；地塞米松碟酸钠注射液（Dexamethasone, Dex ) 国药准字H41020055,郑州卓峰制药有限公司；卵清 蛋白（Ovalbumin, OVA),美国 Sigma 公司；兔抗 Notch 1、Jagged 1、Hes 1、NF - kB 及卩-actin 抗体，羊抗兔 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP)标记二 抗、增强型RIPA蛋白裂解液、彩色预染蛋白Marker (10 ~180 KDa)、PVDF 膜及 SDS - PAGE 凝胶制备试 剂盒等均购自武汉博士德生物工程有限公司；Trizol 总 RNA 抽提试剂、Easy - Load™ PCR Master Mix (Blue, x)、BeyoRT™ II cDNA第yi链合成试剂盒等 由上海碧云天生物技术有限公司南通分公司提供； PCR实验所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 设计合成。

1.3实验动物分组及处理将SD雄性大鼠随机分为6组，每组10只，分别为：正常对照组、哮喘模型 组、地塞米松及大豆肽高、中、低剂量组。正常对照组 于实验第1 d和第7 d腹腔注射生理盐水0. 2 ml,其它 各组于实验第1 d和第7 d腹腔注射致敏ye（OVA 5 mg +氯氧化铝200 mg +生理盐水1 ml充分混悬）0. 2 ml。第8 d,将大鼠置于诱咳引喘仪（XR - YLS -8A 多功能诱咳引喘仪，上海欣软信息科技有限公司）中， 正常对照组大鼠用生理盐水进行雾化激发，其它组用 1% OVA生理盐水溶液进行雾化，1次/d,每次30 min。从雾化第2 d开始,于每次激发前正常对照组和 哮喘模型组灌胃生理盐水，地塞米松组大鼠腹腔注射 地塞米松0. 5 mg/kg,大豆肽组大鼠分别灌胃大豆肽 600、00及150 mg/kg,连续激发和给药7 d。末次激 发24 h后，将大鼠麻醉，快速取下肺组织，收集肺泡灌 洗液,进行白细胞分类计数，然后将肺组织用生理盐 水冲洗干净，取右下叶肺组织用于组织学检测，剩余 组织冻存于-80C超低温冰箱中备用。

1.4大鼠肺组织形态学观察取大鼠右下叶肺组 织，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,经系列浓度乙 醇脱水后进行石蜡包埋、切片及HE染色，显微镜下 观察肺组织病理学改变。

1.5 RT - PCR法检测大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表达水平取大鼠左上叶肺 组织约50 ~60 mg,置入盛有液氮的研钵中充分研磨 至粉末状，加入1. 5 ml Trizol充分混匀裂解消化，12 000 rpm 4C离心20 min,吸取上清，根据试剂盒说明 书操作步骤进行RNA抽提和逆转录反应。将逆转录 得到的cDNA进行PCR扩增实验，各待测基因引物序 列见表1。

1.6 Western blot 法检测大鼠肺组织 Notch 1、Jagged 1、Hes1及NF - kB蛋白表达水平取大鼠左下叶肺 组织约80〜100 mg,剪碎置于离心管中，加1.5 ml RIPA裂解液于冰上充分匀浆,然后再裂解约30min, 4C 12 000rpm离心15min,取上清移入1.5mlEP管 中，进行蛋白定量，并调整浓度一致。将上清样品与 蛋白上样缓冲液等体积混匀后煮沸5min,以25 ^l/

孔上样，进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，依 次进行封闭、一抗、二抗孵育、显色及拍照等步骤，以 p - actin 为内参,分析待测蛋白相对表达值。

1.7统计学处理用SPSS18.0统计软件进行数据 处理,数据以Mean 盨D表示，多组间的两两比较采 用单因素方差分析（ one - way ANOVA)和 LSD - t 检 验，检验水准为a =0.05。

₂ # 中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数明显增多

(P<0.001);与哮喘模型组比较，大豆肽600、300 2.1大豆肽对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的 mg/kg组大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸 影响与正常对照组比较，哮喘模型组大鼠BALF中 性粒细胞数显著降低（P <0.001)。结果见表2。

表2大豆肽对哮喘大鼠BALF中白细胞分类计数的影响（x 眘，= 10)

注：与正常对照组比较,P <0.05, ^bP <0.01;与哮喘模型组比较,P <0.05, ^dP <0.01

2.2大豆肽对哮喘大鼠肺组织病理学变化的影响 增厚，管腔变窄，部分有胶原沉积；大豆肽600、00

正常对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡无萎缩塌陷， mg/kg组大鼠肺组织病理损伤较模型组明显改善，炎

气道内壁未见增厚，偶见炎性细胞浸润；哮喘模型组 性细胞浸润减少，肺泡结构较为完整，但仍不能恢复

&:正常对照组沁：哮喘模型组;〇:地塞米松组;3:大豆肽600瓜呂八呂;6:大豆肽300瓜呂八呂;£:大豆肽150瓜呂八呂大鼠肺组织可见多量、散在的炎性细胞浸润，气道壁 至正常。

图1大豆肽对哮喘大鼠肺组织病理形态的影响（X200)

2.3大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表达水平的影响与正常对 照组比较，哮喘模型组大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表达水平明显上调（P < 0.001);与哮喘模型组比较，大豆肽600 mg/kg组大

鼠肺组织 Notch 1、agged 1、Hes 1 及 NF - kB mRNA 表达水平显者下调（P <0. 001)。结果见图2、表3。 2.4大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB蛋白表达水平的影响与正常对照 组比较，哮喘模型组大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、

Hes 1及NF - kB蛋白表达水平明显上调（P < 鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB蛋白表

表3大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB mRNA表达水平的影响（x 土 s, n = 10)0.001);与哮喘模型组比较，大豆肽600 mg/kg组大 达水平显著下调（P <0.001)。结果见图3、表4。

注：与正常对照组比较,P <0.05, ^bP <0.01;与哮喘模型组比较,P <0.05, ^dP <0.01

表4大豆肽对哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF- kB蛋白表达水平的影响（x 土 s, n = 10)

注：与正常对照组比较,P <0.05, ^bP <0.01;与哮喘模型组比较,P <0.05, ^dP <0.01

3讨论

支气管哮喘是多种炎性细胞浸润或炎症介质参 与的以气道高反应性及重塑为特点，伴有气管痉挛、 呼吸困难、咳嗽及喘息等症状的呼吸系统炎症性疾 病^&]。在本研究中，与正常对照组比较，哮喘模型组 大鼠BALF中中性粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞 计数明显增多，且HE病理切片观察到气管壁增厚， 管腔变窄，可见多量散在炎性细胞浸润，以上结果与 哮喘的炎症变化及病理学改变相一致，表明OVA致 哮喘大鼠模型成功建立。同时，与哮喘模型组比较,大豆肽600、00 mg/kg可减少哮喘大鼠BALF中中性 粒细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞数，且肺组织病理 学损伤得到明显改善，提示大豆肽可减轻哮喘大鼠气 道炎症，改善肺组织病理性损伤，对哮喘有一定的防 治作用，但大豆肽防治哮喘的具体机制尚不明确。研 究表明，炎症是导致哮喘患者或哮喘动物模型气道增 殖、气管重塑及肺组织损伤等病理变化的重要因素， 控制炎症反应是缓解哮喘症状的重要措施⁸ ,为此本 研究以 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF - kB 这^_炎症信 号通路为研究靶点，探讨大豆肽抗炎平喘分子机制。

哮喘的发生发展与炎症细胞释放炎性介质（如

IL-lp、IL-6及TNF-a等）激活Notch 1信号通路 密切相关⁹ — ^10]。Notch 1信号通路由其相应的配体 (Jagged 1)、受体（Notch 1)及上下游信号效应分子 (Hes 1、NF - kB)等组成，其调节异常可介导哮喘炎 症的发生，参与气道增殖、气管重塑等病理过程^[11]。 在炎症刺激作用下，Jagged 1与Notch 1相互结合， Notch 1 路即被激活，高表达 Notch

(notch intracellular domain, NICD)被释放，其下游 Hes 1等关键靶基因被启动，从而上调气道上皮胶原蛋白 的表达，诱发气道上皮下增殖和纤维化，引起哮喘气 道重塑等病理性损伤^[12-13]。NF - kB是Notch 1信号 通路调控巨噬细胞介导的炎症反应主要靶分子之一， Notch 1通路活化后，激活I - kB激酶（I - kB kinase, IKK), IKK作用于I - kB使其发生磷酸化，使得NF - kB/ I - kB二聚体复合物解离,NF - kB发生磷酸化 并通过核膜转移进入核内，与DNA特异性结合位点 相互作用，快速启动IL - 6、IL - 5及TNF - a等靶基 因的转录,生成相应的炎症因子，促使炎症反应的发 生^[14]。同时,生成的炎症因子又是Notch 1和NF - kB 的活化剂，进一步激活 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF -kB信号通路，如此周而复始使炎症反应持续放大 和扩散，使哮喘症状不断加重，诱发气道内皮细胞增 殖和气管重塑等病理性损伤^[15]。本研究发现，大豆 肽600 mg/kg可使哮喘大鼠肺组织Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表达水平明显下降， 提示其抗炎平喘机制与下调Notch 1/Jagged 1/Hes 1/ NF-kB信号通路有关。