龟鹿二仙胶对创伤后应激障碍模型大鼠行为学 及海马GR、5-HT受体表达的影响

目的:观察龟鹿二仙胶对创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder, PTSD)模型大鼠行为学，海马糖皮质激素受 体（glucocorticoid receptors, GR)及 5-羟色胺（5-iydroxytryptamine, 5-HT)受体 1A 亚型（5-HT1A)、2A 亚型（5-HT2A)表达的 影响。方法:采用单一延chang刺激方法制作大鼠PTSD模型,通过旷场实验、拒俘反应实验以及Morris水迷宫实验观察大鼠 的情感行为和学习记忆能力的改变。采用RTTCR法检测海马GR、5-iT1A和5-HT2A受体表达。结果:PTSD大鼠表现 出多种情感行为障碍，学习能力显著降低（P <0.01)。海马GR表达增强（P <0.01),5-HT1A受体表达下降（P <0.05), 5-HT2A受体表达则升高（P <0. 05)。龟鹿二仙胶(2.025 g ?kg ?¹)和ying羊藿总黄酮（0. 06 g ?kg?¹)能显著改善PTSD大 鼠的情感行为障碍，提高学习记忆能力（P<0. 05或P<0. 01)。龟鹿二仙胶（2.025 g ?kg?¹)和ying羊藿总黄酮（0.06 g ?kg¹)可以明显降低PTSD大鼠海马GR的表达水平，升高5-HT1A受体表达水平和降低5-HT2A受体表达水平（P < 0.05或P<0.01)。结论:龟鹿二仙胶对PTSD具有良好的干预治疗作用，其作用机理与改善情感行为和认知功能以及调 节海马GR、5-HT1A和5-HT2A受体表达有关。

近年来，创伤后应激障碍（post~traumatic stress disorder, PTSD)的患病率呈逐年上升趋势^m。PTSD 属于精神心理综合征的范畴，是个体经历超常的威 胁性、灾难性的创伤事件后，呈现典型、常见的 身心障碍⁰。PTSD不仅给个人、家庭带来极大负 担，还进一步影响着社会的稳定和谐。中医药以其 *的理论和治法方药在防治PTSD研究方面，显 示出良好的应用前景。本课题组以‘‘肾藏精，在志 应恐”的中医理论为指导，运用龟鹿二仙胶开展防 治PTSD的相关研究。初步的研究结果表明，龟鹿 二仙胶对条件性恐惧记忆的形成具有抑制作用^H。 本实验通过建立PTSD大鼠模型，观察大鼠行为学、 海马糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR)和 5-羟色胺（5~hydroxytryptamine, 5~HT)受体 1A 亚型 (5~HT1A)、A亚型（5~HT2A)表达的影响，进一步 明确龟鹿二仙胶防治PTSD的效应及其部分机理。

1材料与方法

1.1实验药物龟鹿二仙胶:产品购自河南省新四 方制药有限公司，国药准字Z41022262,批号: 090105,规格:每瓶200 g。ying羊藿总黄酮：产品购自 陕西省西安市天园生物制剂厂，批号:TY20090620, 规格:每瓶200 g。ying羊藿总黄酮用蒸馏水配制为 30 g • L^-1的溶液，每次配制250 mL,置于4 °C冰箱 内保存备用。盐酸氟西汀胶囊：产品购自美国礼来 苏州制药有限公司，规格：每粒20 mg,批号: 204362,用生理盐水将胶囊内粉末配制成0. 18 g • L^-1混悬液,4 C冰箱内保存备用。

1.2 实验动物 SPF 级 Sprague-Dawley (SD)雄性 大鼠,体质量（180 ±20) g,购于广州中医药大学实 验动物中心（实验动物质量合格证号分别为： 0061199,0065089,0067723),自由饮食，在光暗周期 为12 h,温度为（23 ±2) °C、通风良好的实验室条件 • 532 •

适应性喂养7 d。每天轻抚大鼠5 min,使其逐渐适 应实验者的操作。

1.3实验试剂Trizol提取总RNA试剂盒（美国 Invitrogen公司），逆转录■聚合酶链式反应试剂盒、 TaqDNA 聚合酶、dNTP、Access Quick™ RT-PCR sys-tem (美国 Promega 公司）， SYBR Green 荧光染料 （美 国 Gibco 公司），SYBR Green PCR Master Mix (美国 MJ公司），PCR引物合成（上海生工生物工程技术 服务有限公司）。

1.4实验仪器XR-XZ301大鼠旷场实验分析系 统（上海欣软信息科技有限公司），水迷宫Smart视 频追踪系统（San Diego Instrument,美国），LE-CEND MICRO 21R台式高速冷冻离心机（Th ermo 公司，美 国），Prism 7000 型 Real-time Quantitative PCR system (MJ公司，美国）。

1.5实验方法实验动物按体质量随机分为7组， 即对照组，模型组,龟鹿二仙胶高剂量组、低剂量组， ying羊藿总黄酮高剂量组、低剂量组，盐酸氟西汀组。 对照组不应激、不给药，灌服等量生理盐水;模型组 给予单_延chang刺激，不给药，灌服等量生理盐水。龟 鹿二仙胶高剂量组、低剂量组第1天造模，第2天开 始每天分别给予龟鹿二仙胶1. 012 5 g • kg^-1和 2.025 g • kg^-1灌胃，连续14 d。ying羊藿总黄酮高剂 量组、低剂量组第1天造模，第2天开始每天分别给 予ying羊藿总黄酮0. 03 g • kg^-1和0. 06 g • kg^-1灌 胃，连续14 d。盐酸氟西汀组第1天造模，第2天开 始每天给予盐酸氟西汀1.8 mg • kg^-1灌胃，连续 14 d。各组大鼠第16天进行旷场实验、拒俘反应实 验、Morris水迷宫实验等。

1.5.1 PTSD模型制作采用*的单一延

chang刺激（single-prolonged stress, SPS)造模方法，由 2005年日本文部省召开的“基础和临床研究进展” 会议确定⁴ ,单_延chang刺激处理步骤如下：将

大鼠禁锢2 h后，立即强迫游泳20 min (水温25 °C , 水深40 cm),休息15 min后，yi醚麻醉至意识丧失, 不再给予任何刺激，在笼中自然苏醒,常规饲养直至 取材。禁锢过程中采用的材料为锥体形的硬质塑料 筒,其长度和直径可根据大鼠体形的特点进行调节。 大鼠尾部始终暴露在禁锢材料外，其躯干及四肢不 受压迫，但无法自由活动。

1.5.2旷场实验实验装置包括旷场反应箱和数 据自动采集和处理系统两部分，大鼠旷场反应箱内 全涂黑，箱高40 cm,底边长100 cm,底面平均分设 25个小方格(4 cm X 4 cm),正上方2 m处固定数码 摄像头，视野范围覆盖旷场内部。旷场白天光照由 两侧墙壁的4只节能灯发出约200 lux照度来模拟, 夜晚照明由一侧墙的红外光源提供。室内隔音。观 察5 min内大鼠的行为表现，指标包括水平活动距 离，直立、呆滞、修饰行为次数，排便颗粒数。每次实 验均在上午7 : 00 -12 : 00进行，两次实验之间将 箱底打扫干净。

1.5.3拒俘反应实验用手套（大鼠从未接触过） 轻抓大鼠，观察并记录其反应。具体记分标准如下: 0分,很容易抓取;1分,尖叫或回避;2分，尖叫并回 避;3分,逃脱;4分，逃脱并尖叫；5分，试图撕咬手 套;6分，主动跃起攻击。根据评分来评价大鼠恐惧 与冲突素质特征改变⁵。

• Morris水迷宫实验各组大鼠第16天进 行Morris水迷宫实验，水温设定为25 C,实验方法 参照文献6]进行。首先进行大鼠寻找水中平台 (高出水面1 cm)的训练，每只大鼠先置于平台上适 应25 s,然后从N、S、E、W4个不同象限的入水点将 其投入水中，若超过60 s大鼠仍未抵平台，由实验 者引导其回到平台上停留15 s,如此重复3次，擦干 大鼠放回饲养笼。同一天进行定位航行实验。测试 时,随机从N、S、E、W 4个象限中任一象限将大鼠面 向池壁放入水中进行观察。若大鼠找到平台，并在 平台上停留5 s后，视频追踪系统停止记录，大鼠找 到平台前在水中游泳的这段时间记为逃避潜伏期 (escape latency, EL)。若大鼠60 s内未找到平台， 此时的EL记为60 s。定位航行实验连续测试5 d, 每天1次，记录大鼠的EL。第5天的测试结果作为 各组大鼠空间学习记忆能力。
• 海马 GR、5^mA、54IT2A 受体 mRNA 表

达RT~PCR法检测。各组动物麻醉后断头取脑， 在冰台上快速分离海马组织，置于-80 C冰箱保 存。使用的试验器材均经灭活RNA酶处理。采用 Trizol总RNA提取试剂盒提取标本中的总RNA,以 提取的总RNA为模板，按试剂盒说明将总RNA逆 转录成cDNA后检测海马中GR、5-HT1A、5-HT2A 受体mRNA的表达量。PCR扩增条件为：95 C10 min,95 C15 s,60 C20 s,72 C30 s,共 40 个循环。 建立双标准曲线:取对照样本cDNA, 10倍梯度稀释 后，各取样品2 ^L作为模板,然后用目的基因引物 和内参基因引物分别进行扩增。同时在75 ~90 C 进行溶解曲线分析，并绘制出目的基因和内参基因 的标准曲线。将各样品cDNA进行4倍梯度稀释， 稀释后取2卟作模板,分别用目的基因引物和内参 基因引物进行扩增，同时在75 ~90 C分析溶解曲 线。采用 Prism 7000 型 Real~time Quantitative PCR 仪检测，以管家基因甘油醛-3磷酸脱氢酶（glyceral- dehyde-5~phosphate dehydrogenase, GAPDH)作为内 参，采用2^-^法^&]分析GR、5-HT1A、5~HT2A受体 的基因相对表达量。2^{- AACt}法相对定量分析结果判 定：循环阈值。PCR引物序列：GAPDH上游：5'- ACATGCCGCGTGGAGAAACCT-3',下游:5'~GCCCA- GGATGCCCTTTAGTGG-3'; GR 上游：5'-AGCAGAG- AATGTCTCTAC-3',下游:5'~GGAATTCAATACTCAT- GGTC-3'; 5-HT1A 上游：5'-TCACCTGCGACCTGTT- TATC-3',下游:5'-GCTCCCTTCTTTTCCACCTT-3';5- HT2A 上游：5'-CATCATGGCAGTGTCCCTAG-3',下 游:5'-GGTAAATCCAGATCGCACAG-3'。

AQ = ^Ct样品均值^一Ct内参均值

AA^Ct = AQ ^- (Q阴性对照样品均值^-Ct内参均值）

1.6统计学方法采用SPSS 20. 0统计学软件，实 验结果以均数±标准差（x ± s)表示，组间比较采用 LSD法。P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠旷场实验结果比较与对照组比较， 模型组大鼠在水平活动距离，直立、呆滞、修饰行为 次数，排便颗粒数等方面均有显著改变（P <0. 01); 龟鹿二仙胶(2.025 g • kg^-1)和ying羊藿总黄酮（0.06 g • kg^-1)对PTSD大鼠旷场行为学指标均有显著改 善（P <0.05 或 P <0.01)

PTSD的主要临床表现包括创伤性事件的再体 验、持续性高警觉、闪回和麻木。单一延chang刺激造模 方法包含心理应激（禁锢）、生理应激（强迫游泳、yi醚麻醉），模拟出人类在自然环境中可能遭受到的

主要应激类型，能使大鼠出现惊恐行为、活动度降 低、学习和记忆能力减弱等多种PTSD样的精神和 行为异常⁰⁸ ,是目前较为成功的PTSD动物模型。

旷场实验是检测动物情绪唤醒水平、神经精神 变化的一种重要方法，对于量化分析实验动物的精 神紧张度、警觉水平、焦灼状态、环境适应能力等具 有重要意义°³。本研究中旷场实验和拒俘反应实 验的结果显示,PTSD大鼠活动习性明显改变、警觉 水平增高、环境适应能力明显下降，始终表现出受惊 吓逃避的情感应激反应；拒俘反应性呈现同步显著 增强，容易激惹、挣扎行为明显，冲突特性增强。 Morris水迷宫实验结果显示,PTSD大鼠逃避潜伏期 明显延长，说明其学习能力显著降低,存在着显著的 认知功能障碍。

下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamus—)ituitary~ad- renal gland, HPA)轴是参与应激反应并对应激进行 有效调控的神经内分泌系统。大量的研究已经证 实,PTSD患者存在着HPA轴功能的紊乱^M。糖皮 质激素是HPA轴分泌的主要应激激素。 Quervain 等⁰¹¹通过临床试验证实，提高体内糖皮质激素的水 平能够抑制恐惧记忆的重现，从而减轻PTSD和恐 惧症患者的症状。海马是参与环境调控条件性恐惧 的重要脑区^M ,同时也是HPA轴的重要调节位点。 海马中的GR密度远高于其他脑区⁰¹³ ,糖皮质激素 通过与GR和盐皮质激素受体结合发挥生物学效 应,GR在糖皮质激素的负反馈调节以维持HPA轴 功能平衡中起着重要的作用^M。

研究结果显示,GR的表达水平升高⁰¹⁵ ,本实验 的结果也显示PTSD大鼠海马GR的表达增强，这与 PTSD糖皮质激素对HPA轴负反馈抑制作用增强是 —致的;而GR的高表达可能与PTSD的情感行为障 碍、认知功能受损的发生发展过程有关。

关于PTSD的发病机制目前尚不明确，但大量 文献结果表明,5~HT水平异常与PTSD的发生密切 相关，抗抑郁药5~HT重摄取抑制剂作为治疗PTSD 的shou选方案^M。5~HT可能通过5-羟色胺转运体、 5-HT受体以及与多巴胺、去甲肾上腺素等的相互作 用参与PTSD的发生⁰¹⁷。海马富含突触后膜5- HT1A受体,5~HT1A受体和情感障碍关系非常密 切⁰¹⁸。有研究表明，PTSD动物5-HT1A受体活性 与下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素有关，并且参 与杏仁核神经元凋亡过程¹³。研究表明，5~HT释 放产生的焦虑效应主要产生于5-HT2A受体的激 活。此外，应激发生时5-HT还可能通过5-HT2A受 体发挥对HPA轴的调控作用⁰²⁰。单程长时应激2 周后，海马脑区中5~HT2A受体亲和力和受体数目 明显增加；不可逃避刺激可使海马、杏仁核以及下丘 脑5-HT2A受体表达呈升高趋势⁰²⁰。临床研究也 发现,5~HT2A受体拮抗剂萘法唑酮对战争相关的 PTSD患者具有明显改善作用⁰²¹。本实验结果显 示,PTSD大鼠海马5~HT1A受体表达下降，而5- HT2A受体表达升高，说明单一延chang刺激应激可能 通过影响5-HT1A受体和5-HT2A受体mRNA的表 达，进而影响海马对情绪反应、学习记忆等的调节功 能，参与PTSD的一系列精神情感障碍以及认知功 能减退等病理过程的发生。

PTSD属于中医情志病的范畴。中医认为，“脑 为髓之海’“肾主骨生髓’“肾藏精，在志应恐”。因 此，肾可视为与恐相应的机体情志活动的储备之脏， 而涵藏于肾中的精气则是情志活动*的物质基 础。肾中精气充盈与否与机体情志活动能否正常发 挥关系密切。基于中医“肾藏精，在志为恐”理论， 笔者认为，PTSD的发生是内因和外因协同作用的结 果。外因主要源于外界重大创伤性事件的强烈刺 激，内因主要由于稟赋不足或久病暗耗所致的肾精 不足，使机体应对外界刺激的整体能力下降。精足 则神旺，肾精不足，脑髓失养，则易引发恐惧、焦虑、 抑郁、绝望等各种情志活动的异常。肾藏志应恐，惊 恐伤肾，气机逆乱，则气下精伤，志意失藏，进而累及 五脏整体功能出现异常。因此,PTSD发病的中医核 心病机凝炼为“肾精不足，封藏失职，志气衰败”。 有研究发现，补肾方药金匮肾气丸可有效纠正地震 恐惧导致的子鼠神经发育迟缓等，对受恐惧影响的 大鼠其血清皮质酮、神经递质（5~HT、DA)等出现的 代谢紊乱具有调节作用⁰²² ,可明显改善PTSD患者 对单一西药治疗药物的依赖性和核心症状、抑郁和 焦虑状态⁰²³ ;滋补肾精方药能提高“恐伤肾”雌性小 鼠的雌二醇、促卵泡激素和黄体生成素水平⁰²⁴ ;温 补肾阳方药能明显改善PTSD大鼠Open-Field评 分、糖水摄取量、血浆17-)HCS及cAMP等⁰²⁵。

龟鹿二仙胶是中医临床治疗各科虚证的基本 方，由鹿角胶、龟板胶、枸杞子、人参组成。鹿角胶能 补肾阳、生精血;龟板胶能滋阴潜阳，补血;人参大补 元气而生津;枸杞子益精生血。诸药合用，共奏补肾 填精、益气养血、阴阳并补之功效。我们前期研究工 作表明，龟鹿二仙胶能明显抑制肾虚大鼠恐惧记忆 的形成,促进恐惧消退⁰²。本研究发现，在行为学 方面，龟鹿二仙胶能降低PTSD大鼠的高警觉水平 以及惊恐逃避情感反应，提高大鼠的学习记忆能力 和认知功能。此外，龟鹿二仙胶可以降低PTSD大 鼠海马GR的表达水平，调节PTSD出现的HPA轴 功能紊乱；同时，龟鹿二仙胶还可通过升高PTSD大 鼠海马5~HT1A受体表达水平和降低5~HT2A受体 表达水平，参与PTSD情感障碍的调节。

综上，龟鹿二仙胶对PTSD具有良好的干预治 疗效应,其作用机理与改善情感行为和认知功能以 及调节海马GR、5-HT1A和5-HT2A受体表达有关。