一、支原体检测试剂盒的产品特色：  

（1）仅需1μl培养细胞上清液和1台水浴锅，不需要提取基因组DNA，不需要荧光显微镜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、生物发光检测仪等复杂实验设备；  

（2）仅需1h出结果，简单快速灵敏的细胞支原体检测方法；  

（3）仅需一步操作完成整个实验，实验结果根据反应液颜色变化肉眼直观容易辨别，无需电泳，避免多步操作开盖带来的假阳性风险；  

（4）灵敏度远远高于PCR法，能够检测细胞培养中常见的多种支原体（猪鼻支原体、jing氨酸支原体、口腔支原体、莱氏无胆甾原体、发酵支原体、唾液支原体、人型支原体、梨支原体，占支原体污染的98%）。  

二、支原体检测试剂盒组成（25T）：

三、实验步骤：  

（1）待测细胞培养液上清准备  

待测细胞在培养2-3天且融化度最好达到80%以上时取细胞培养液200μL以上体积，按照200g离心5分钟，然后取上清液进行后续检测（不要取到管底部50μl培养液及细胞沉淀即可）；  

（2）反应体系配制（首先将溶液A、溶液B、阳性对照、石蜡油解冻融化后立即放置于冰上）  

将溶液A从-20℃取出，待其解冻融化后，上下轻轻颠倒混匀。根据待测细胞样本数量在微量离心管中配制如下反应体系（反应体系配制过程在冰上进行非常重要）；

备注：每次实验需要1个阴性对照、1个阳性对照及由于移液器存在移液误差，所以检测N个样品一般推荐配制N+3个上述反应体系  

用震荡器轻轻混匀，然后分装到PCR管中（推荐使用200μl体积PCR管），每管分装24μl上述混匀后的反应液；  

（3）上样（整个上样过程保持冰上进行非常重要，特别是反应液上方覆盖的石蜡油需要冰上预冷）  

待测样品：向反应管中加入1μl待测离心后培养液上清，然后用此加液枪上下移动轻轻吹打5次；  

阴性对照：不加入任何样品或加入1μl无菌水；  

阳性对照：加入1μl阳性对照样品，然后用此加液枪上下移动轻轻吹打5次；  

然后每反应管溶液上方轻轻中加入25μl石蜡油（水浴锅中进行反应），以防止液体蒸发导致结果不准确。加入石蜡油时请注意每次更换枪头，防止样品之间交叉污染。如果反应是在PCR仪中进行反应，不需要加入石蜡油。  

（4）反应  

将水浴锅或PCR仪温度设置成61℃，放入反应管，孵育60min；  

备注:  

1、水浴锅实际温度可能与设置温度有所偏差，建议先用温度计进行校准。实际上59-63℃反应都可以进行，但会影响检测灵敏度；  

2、反应产物不可开盖，否则产生的气溶胶会导致后续检测假阳性的出现。建议将反应管包扎在塑料袋或手套中,丢弃到专用垃圾桶中,并及时清理；  

3、不建议使用烘箱或金属浴进行加热反应；  

（5）结果判断  

61℃反应60min后，立刻取出反应管，放于室温。在光线良好的环境中观察反应结果（建议以白纸为背景）。如果反应液仍为蓝紫色，则判定为阴性；若反应液为天蓝色，则判定为阳性。

四、相关文献  

1、ShiyuHe,YanzhiHuang,YanlingZhao.AReverseTranscription-PolymeraseSpiralReaction(RT-PSR)-BasedRapidCoxsackievirusA16DetectionMethodandItsApplicationintheClinicalDiagnosisofHand,Foot,andMouthDisease.FrontiersinMicrobiology.2020;12(11):734-743.  

2、AudreyJean,FlorenceTardy,OmranAllatif.AssessingmycoplasmacontaminationofcellculturesbyqPCRusingasetofuniversalprimerpairstargetinga1.5kbfragmentof16SrRNAgenes.PLOSONE.2017;12(2):e0172358.  

3、ZohreSoheily,MohammadSoleimani,KeivanMajidzadeh-Ardebili.DetectionofMycoplasmaContaminationofCellCulturebyALoop-MediatedIsothermalAmplifcationMethod.CellJ.2019;21(1):43-48.  

4、XinXu,XueyuWang,WenHu.AnImprovedPolymeraseCross-LinkingSpiralReactionAssayforRapidDiagnosticofCanineParvovirus2Infection.FrontiersinVeterinaryScience.2020;7(57):1629-1636.