一、产品介绍

铺板工作液（hESC/iPSC Planking Solution）是使用VTN 包被蛋白（Vitronectin）配制的即用型工作液，VTN是一种成分确定的，无异源成分的细胞基质，能够支持hESC/iPSC的生长和分化，可以与多能干细胞培养基一起使用，用于hESC/iPSC体外无饲养层培养。

hESC/iPSC细胞培养试剂盒说明书下载

二、产品信息

表 1： hESC/iPSC 培养基 试剂盒产品内容

表 2： hESC/iPSC 其他相关试剂 产品内容

三、试剂材料

表 2：其他试剂&材料

四、 试剂准备

1 ）hESC/iPSC 培养基配制（500 mL ）

1. 在 4℃条件下解冻 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B，勿在 37℃培养箱/水浴锅解冻。

2. 参考表 表 3 在生物安全柜中，使用无菌移液管混匀下列成分配制成 hESC/iPSC 培养基，之后置于 4℃储存，封口膜封好后 2 周内使用。

3. 有初培养需扩建的需求，建议先配置 100 mL,保证 2 周内使用完毕。

表 3：hESC/iPSC 培养基配置说明*

可根据实际用量将 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 分装后冷冻保存。具体配置比例可参考表 3 的配置说明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 冻融总次数不能超过 2 次。

2 ）Matrigel 铺板（以货号为 354277 的 的 Corning® Matrigel® 包被 6 孔板为例 ）

A. 装 分装 Matrigel

1. 货号 354277 的 Matrigel，操作说明中不标注蛋白浓度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推荐 Dilution Factor 为 278 μL，则表明 278 μL 可包被 4 块 6 孔板，分装数量=5 mL/0.278=17.98。

2. 准备 18 个无菌 1.5 mL EP 管，标记 Matrigel 日期、操作人；1mL 无菌吸头；EP 管架，均置于-20℃冰箱中预冷 1 小时。

3. 将 Matrigel 放置 4℃冰箱过夜解冻，当 Matrigel 解冻即可开始分装。

注：在解冻时，将 Matrigel 放置冰箱内侧角落，切勿放在靠近冰箱门附近。

4. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的 Matrigel、预冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸头放置于生物安全柜上。

5. 混匀 Matrigel，无菌分装于各个 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。当吸头被堵塞可能导致分装体积不准时需要更换吸头。

6. 将分装后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 铺板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 离心管中，准备 4 个 6 孔板，标记 Matrigel、批号、日期和操作人。

2. 1 mL 无菌吸头置于-20℃冰箱中预冷 1 小时，取出一支冷冻的 Matrigel（5mL）置于 4℃冰箱解冻至化冻。

3. 准备一个装满碎冰的冰盒，将解冻过的 Matrigel、预冷的 1mL 吸头放置于生物安全柜上。

4. 用预冷的吸头向解冻过的 Matrigel（5mL），加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反复吹打解冻并混匀。

5. 吸出已解冻混匀的 Matrigel 加入离心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反复吹打混匀。

6. 分装 1.5 mL/孔于 4 个六孔板中，轻轻摇晃混匀。

7. 培养板置于室温 1 小时后即可使用，或置于 4℃冷藏过夜，两周内使用。

五 、 复苏 hESC/iPSC （以 6 孔板为例）

1. 将水浴锅预热至 37℃。

2. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（15~30℃）。

3. 取 4 mL hESC/iPSC 培养基，按照 1:4000 比例加入 1 μL 的 hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（15~30℃）。

TIPS：不要在 37℃水浴锅中预温培养基。

4. 取出 1 支冷冻的细胞置于 37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min 内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将消失时取出。

5. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的 15 mL离心管中，随后逐滴加入 10mL DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160 g 离心 5 min。

6. 吸弃上清，加入预温的 4 mL 的 hESC/iPSC 培养基混匀细胞，尽量避免吹打。

注：可留 20 μL 上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。

7. 吸除 6 孔板中 2 孔的 Matrigel 包被液，将混匀的细胞按照 2 mL/孔接种到 2 孔中。

8. 水平十字摇匀三次，置于 37℃，5% CO 2 浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。

9. 18-24 小时后换新的 hESC/iPSC 培养基，之后每天更换培养基。

注：在 hESC 培养过程中，如果细胞的汇合度超过 50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至 3-4mL/孔。

表 4： hESC/iPSC 传代&培养操作试剂推荐用量

六 、传代 hESC/iPSC （以 6 孔板为例）

1. 传代条件：① 细胞汇合度达 85%左右（如图 1(C-D)所示），一般情况下每 3-4 天传代；

② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过 5 天。

2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按 1:5~1:12 的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度 85%，大小均匀（如图 1(C-D)所示），建议按照 1:8 进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例；密度偏高，则增加传代比例。

注：1:8 传代就是 1 个孔瓶传 8 个孔（以 6 孔板为例）。

3. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。

4. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 培养基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y） ，恢复至室温（~25℃）。

图 1.hESC/iPSC 培养基连续培养 hESC 细胞形态图 ：（A ）和（C ） 分别为 hESC 细胞培养第 2 和 4

天时 低倍镜 hESC 培养 形态图示， （B ）和（D ） 为培养至第 2 和 和 4 天时的 高倍镜 hESC 培养 形态图。

5. 将 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中约 1 小时恢复至室温（~25℃）。

6. 根据传代接种的孔数准备 2 mL/孔的 hESC/iPSC 培养基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢复至室温（~25℃）。

7. 将孔内培养基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液覆盖孔底。

9. 置于 37℃培养箱中孵育 8-9 min。

注：① 消化 8-9 min 后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；

② 保持 6 孔板与培养箱金属隔板直接接触，使 6 孔板受热均匀，不要叠放。10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及时加入 2 mL/孔预温的 hESC/iPSC 培养基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字摇晃 6 孔板使细胞脱离基质。

注：① 加 hESC/iPSC 培养基+ hESC/iPSC Supplement C 时，可轻柔吹打细胞 1-2 次，不能超过 2 次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。

② hESC 不能长时间处于 hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速,以及最好一次操作不要超过 4 孔（六孔板）。

图 2 ： 消化 hESC 细胞不同时间 形态图 ： （A ） 消化 8 min 低倍镜 hESC 培养的 的形态图; （B ） 消化 9 min

低倍镜 hESC 培养的 的形态图。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入预温的 hESC/iPSC 培养基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤 9 获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤 9 获得的细胞悬液收集至 2 mL 离心管，轻柔颠倒混匀细胞 1-2 次；再按照传代比例接种。

14. 接种后，水平十字摇匀 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO 2 浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀 6 孔板三次，培养过夜。

15. 18-24 小时后更换新 hESC/iPSC 培养基，此后每天换液，4-5 天后继续传代/冻存。

七、冻存 hESC/iPSC

1. 当细胞汇合度达 85%左右（如图 1(C-D)所示）可收获冻存，一般 6 孔板每孔可冻存 1 管。

2. 准备相应数量的 1.5/2 mL 冻存管，标记细胞名称、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室温预温，使用前注意 摇匀。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃数次，再吸取。

5. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，将细胞置于 37℃培养箱中，计时 8-9 min（可

参考“ 六、传代 hESC/iPSC”步骤）。

6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 摇匀预温的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀 3 次，随后吸取细胞悬液加入 1.5/2 mL 冻存管中。

8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。

八、其他培养体系中 hESC/iPSC 更换为 hESC/iPSC 培养基条件的适应

其他无饲养层条件培养的 hESC/iPSC 可以在细胞状态良好时，使用原培养基进行细胞传代，24 小时后更换成混合培养基（原培养基与 hESC/iPSC 培养基按照 1:1 混合）培养，培养 2 代后换成 hESC/iPSC 培养基培养，培养 2-3 代后可适应新的培养体系，此时可进行细胞冻存处理。