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T7高收率RNA合成试剂盒优化转录反应体系

时间：2024-08-26 阅读：64

T7高收率RNA合成试剂盒优化转录反应体系，利用T7 RNA聚合酶，以T7启动子序列为模板的线性双链DNA，以NTPs为底物控制启动子下游DNA序列，高效合成单链RNA。在转录过程中，修饰过的核苷酸可以加入底物中制备生物素或染料标记RNA。T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit 进行了转录反应体系的优化，试剂盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7启动子序列的线型双链DNA为模板，以NTPs为底物，对启动子下游的DNA序列进行转录，高效合成单链RNA。转录时可在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。

产品信息：

货号	规格	产品名称
HC10111-HC3011	50T	T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit (HC3011), 50 reactions
HC10111-HC3111	50T	T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit (HC3111),50 reactions
HC10111-HC30112	50T	T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit (HC30112), 50 reactions
HC10111-HC30116	50T	T7 Co-transcription RNA synthesis kit (HC30116),50 reactions
HC10111-HC4011	50T	T7 Co-transcription RNA synthesis kit (HC4011),50 reactions
HC10111-HC5011	50T	T7 Co-transcription RNA synthesis kit (HC5011),50 reactions
HC10111-HC7011	50T	T7 Co-transcription RNA synthesis kit (HC7011), 50 reactions
HC10111-HC8011	50T	T7 Co-transcription RNA synthesis kit (HC8011),50 reactions
HC10111-HC9011	50T	T7 Co-transcription RNA synthesis kit (HC9011),50 reactions

产品组分：

T7 RNA Polymerase Mix、10xTranscription Buffer、ATP/CTP/GTP/N1-Me-PUTP、CAP GAG、质粒DNA模板

试剂盒中帽类似物可进行选择，惠诚生物可提供帽类似物:CAP GAG、CAP GAG (3'OMe)、CAP GAU、CAP GAG(m6A)以及新型帽类似物CAP4、CAP5、CAP7、CAP8、CAP 等

以下成分以EasyCаp™ GAG m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 100mM Ammonium solution, GMP grade 货号:CAP3011为例：

编号	名称
10111-A	T7 RNA Polymerase Mix
10111-B	10×Transcription Buffer
10111-C	ATP（100mM）
10111-D	CTP（100mM）
10111-E	GTP（100mM）
10111-F	N1-Me-pUTP（100mM）
10111-G	CAP GAG（100mM）
10111-H	Control DNA Template（500ng/μL）

常见问题解答：

1. 转录产量低

模板的质量与成品率密切相关。试验组的产量显著低于对照组，可能的原因有:①实验模板含有抑制成分;模板有问题。

建议:①重新纯化模板;②确定模板定量及其完整性;③延长反应时间;④增加模板输入量;⑤尝试其他启动子和RNA聚合酶。

2. 短转录产量低

短转录起始片段会抑制该反应。当转录产物小于100 nt时，延长反应时间至4-8 hs或增加模板量至2 μg均可提高RNA产量。

3.RNA转录长度大于预期

如果电泳显示产物条带大于预期条带，可能的原因是:①质粒模板可能没有完(空)全线性化;②感觉链3’端结构突出;③RNA具有未完(空)全变性的二级结构。

建议:①检查模板是否完(空)全线性化，必要时进行额外线性化;②选择合适的限制性内切酶，避免3'外翻，或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成转录后再继续;③用变性凝胶检测RNA产物。

4. RNA转录长度低于预期

如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能的原因是:①模板中含有类似于T7 RNA聚合酶的终止序列;②模板中GC含量较高。

建议:①降低反应温度(如30℃)。有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的RNA聚合酶进行转录;②若模板GC含量较高，可采用42℃转录，或添加SSB以增加产量和转录长度。

5. 转录产物的电泳跟踪

电泳过程中出现拖尾现象。可能原因:①实验操作过程中被RNase污染;②RNase污染DNA模板。

建议:①使用不含RNase的移液针尖和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均使用不含RNase的H2O制备。②重新纯化模板DNA。