Green Retrobeads™ IX 试剂

原装可靠的荧光示踪剂，不要被其他供应商未经证实的说法所误导！对于可靠，稳健的逆行运输，只有一个选择：来自Lumafluor的RetroBeads™。

无论他们如何称呼他们的产品，只有来自Lumafluor的Retrobeads™（普通和IX）已被数百篇已发表的论文证明是有效的，

范围从无脊椎动物到灵长类动物，以及介于两者之间的所有系统。

Lumafluor Retrobeads™:

高度受限注射——非常适合详细的连接性研究。在活细胞中无限期存在（10 ~ 10年！），无毒。

与大多数其他顺行示踪剂、原位杂交和免疫组织化学相容。

将生物活性药物（如神经营养因子和神经递质激动剂/拮抗剂）递送到局部区域；逆行转运可以确定哪些神经元暴露于药物[Riddle等人]。

是专门为促进蛋白质和其他生物活性化合物的吸附而制备的。

灵长类动物系统中的示踪剂是否比标准系统更有效

经过验证的结果

来自Lumafluor的RetroBeads™是用于逆行追踪的原始微球，也是在您的实验中被证明有效的微球。

绿色和红色荧光RetroBeads™由Lumafluor提供，使用荧光乳胶微球或“珠子”作为逆行神经元示踪剂的大多数程序。

Green Retrobeads™ IX 试剂

供应方式：所附小瓶中含有悬浮在蒸馏水中的微珠浓缩溶液。如果红珠用于神经元通路的逆行追踪，溶液可以原样使用，也可以稀释。

在大鼠视觉皮层中，当使用红珠时，1:4的稀释度似乎不会降低逆行标记的质量或程度。

但是，对于初始实验，我们强烈建议使用全强度溶液。除蒸馏水外，标准盐溶液（NaCl, KCl）也可用作稀释剂。

所提供的绿色珠子为逆行示踪实验做好了准备。不建议稀释绿色珠子。

储存：头溶液应储存在加湿的容器中，在冰箱中，以防止蒸发。不要冻僵！被冻住的珠子不会起作用，也无法获救。

如果珠子变干了，它们就不能再合成了。这种材料没有保质期，但是，如果储存得当，它可以保存好几年。

应用：珠子最好使用压力注射（例如1毫升汉密尔顿注射器，或加压空气注射系统）。

对于局部电路工作，通过直径为30-50微米的玻璃移液管注入非常小的体积（30-50毫升）。

对于常规逆行示踪，使用更大的体积（0.1-0.3 ul）和更大直径的移液头。

然而，即使注射量大，珠粒也不会扩散到远离注射部位（通常小于1mm）。

因此，为了标记所有或大部分投射到一个大结构的神经元，需要进行多次注射。

不建议使用离子电泳珠作为递送示踪剂的有效手段。然而，这些珠子确实带一个净负电荷。

存活时间：在大多数温血脊椎动物系统中，注射后的最小有效存活时间约为24小时。标记强度随着生存时间的延长而增加，可达48小时。

48小时后，没有观察到标记强度的增加（或减少）。这些值在冷血动物中可能有很大的不同，建议初始存活时间为一周。

最长生存时间尚未确定，但即使在14个月的生存时间后，标签的质量或范围仍未改变。细胞可能被标记。没有观察到对动物或神经元的毒性作用。

固定和处理：标准固定是0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤，然后在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中加入4%多聚甲醛。

戊二醛会产生大量的组织自身荧光，这可能会模糊头部标记的神经元，如果可能的话应该避免。绿珠在戊二醛固定材料中不可见。

冷冻切片收集在磷酸盐缓冲液中，安装在涂有明胶的载玻片上，风干。干燥后，载玻片可在二甲苯中清除1分钟，并盖上Fluoromount或Krystalon。

Fluoromount可从纽约州Farmingdale的Atomergic chemicals Corp.获得；来自新泽西州吉布斯敦Harleco （EM Industries）的Krystalon。

短暂接触酒精和二甲苯是无害的，但长时间接触（超过5分钟）会破坏珠子。珠子对甘油非常敏感，如果安装在含甘油的溶液中，会迅速褪色。

在需要使用性清除/安装剂的情况下，水杨酸甲酯优于甘油。如果在黑暗中保存载玻片，细胞中的标记至少在一年内不会褪色

（尽管背景自身荧光可能会显著增加）。到目前为止，在塑料植入后保留头部标签的尝试还没有成功。

观察：红色珠子中的染料是罗丹明，因此任何罗丹明的荧光滤光片都可以使用。一些旧的尼康罗丹明滤镜组提供非常高的背景，

这可以使标记的细胞不可见。蔡司和雷兹标准罗丹明滤光片均取得了良好的效果。对于绿色珠子，宽带荧光素过滤器效果很好。

为路西法黄色设置的过滤器会产生更强烈的信号，但代价是更高的背景。窄带荧光素滤光片比宽带滤光片发出的信号要弱得多。

即使经过长时间的观察或显微摄影，珠子也不会明显褪色。

在低倍率、低数值孔径干物镜（如X4、X10）下，通常看不到标签。如果细胞被强烈标记，X10的浸没物镜（数值孔径为0.4或更大），

或更高倍率的干物镜，通常会显示细胞。然而，X25浸入式物镜经常会显示出低倍率物镜看不到的非常清晰的标记细胞。

这些警告对于绿色珠子尤其适用。在确定实验无效之前，用浸泡物镜检查注射部位附近的切片。可见大量的局部标记细胞。

对于绿色珠子使用者的额外信息：在目前所做的工作中，似乎年轻的动物比年长的动物更容易运输标签。此外，年轻动物的组织自身荧光较低。

因此，如果可能的话，在涉及绿珠的实验中，建议使用年轻的动物。

因为绿色珠子比红色珠子在更短的波长下被激发，组织自身荧光是一个更大的问题。因此，努力减少自身荧光将产生更好的对比信号。

减少自身荧光的方法包括：

1)使用更薄的切片（例如30微米而不是40或50微米）；2)使用更年轻的动物，3)在封面滑落后立即检查部分（背景随着时间的推移而增加）。