弱染色或无染色

抗体浓度过低

• 尝试增加一抗浓度

• 考虑使用使用生物素化二抗的扩增系统

抗体不相容性

• 确保二抗与一抗的物种和抗体亚类兼容

高背景会模糊信号

• 请尝试遵循下面本故障排除指南的“高背景或非特异性染色”部分中详细介绍的建议。

膜被透化试剂损坏

• 尝试使用较低浓度的清洁剂。

• 尝试使用较弱的清洁剂（例如用 Triton X-100 代替 Tween-20）

抗体不适合 IHC

• 有些抗体不适合 IHC 中抗原的呈现方式。检查数据表，了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中进行过测试，如果没有，请考虑使用不同的抗体。

• 尝试使用不同的固定方法，该方法将以不同的方式呈现抗原，因此可能允许抗体结合。

目标蛋白丰度低

• 尝试增加一抗浓度

• 尝试使用放大方法，例如生物素化二抗

固定可能会掩盖目标表位

• 尝试第 5.2 节中描述的抗原修复方法之一

抗体对组织切片的渗透性较差

• 尝试将抗体孵育更长时间或以更高的浓度

• 尝试使用更薄的组织切片

• 尝试使用较小的一抗（例如使用 IgG 而不是 IgM）

通透性不足

• 尝试增加缓冲液中 Triton-X100 的浓度。

• 如果使用 Tween-20，请考虑改用 Triton-X100，这是一种更强的清洁剂。

与检测系统使用不兼容的二级荧光团

• 仔细检查所使用的显微镜系统是否具有适合所使用荧光团的正确激发和发射滤光片。

• 考虑使用不同的荧光团偶联二抗。几乎所有荧光显微镜至少都配备滤光片组，能够对 DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 进行成像。

安装后荧光团降解

• 免疫荧光切片封片后 2 天内对切片进行成像。

缓冲区退化

• 使用前检查缓冲液的 pH 值

• 警惕细菌生长的迹象，一旦发现就扔掉。

• 必要时新鲜制作。

降解的一抗

• 确保抗体在制造商提供的最佳使用日期内。

• 考虑将来分装抗体，快速冷冻，然后储存在 -80°C 下，以避免抗体降解的风险。

由于光漂白而损坏荧光团共轭二抗

• 确保使用荧光团共轭二抗时执行的所有步骤都是在弱光或黑暗中进行

• 成像时尽量使用尽可能低的照明来捕获最佳图像。这对于共焦显微镜尤其重要，因为高激光功率设置可以极快地漂白一些荧光团。

• 考虑使用比 FITC 或 TRITC 等旧化合物更耐漂白的荧光团。

不兼容的缓冲区

• 一些抗体在基于 TBS 的缓冲液中表现更好，而其他抗体则更喜欢 PBS。尝试更换缓冲液，看看这是否会增加染色。 

过度固视

• 尝试减少组织与固定剂一起孵育的时间。

• 考虑尝试替代固定液

多路复用时在通道之间渗透

重叠的荧光团激发/发射光谱

• 尝试使用重叠有限的荧光团对（例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594）

• 使用光谱分析工具（例如FPbase Spectraviewer）确保荧光团对之间的重叠有限。

• 尝试使用单一抗体对照，看看一个通道中的信号是真实的还是只是由于渗漏所致。

• 一些先进的图像分析软件具有可以（在一定程度上）校正渗色的功能。

成像系统上的激发和发射滤光片不合适

• 检查荧光团和滤光片之间的兼容性，以确保每个滤光片仅捕获荧光团。

• 对于共焦显微镜，请考虑收紧允许进入检测器的光波长窗口并使用测序，以便每个荧光团只有一个激光处于活动状态。

组织形态改变

冰伤害

• 确保在未来的实验中按照既定方案（例如本文件中列出的方案）冷冻组织。将组织切片放入 30% 蔗糖中时，确保组织已全沉没，否则蔗糖可能没有足够的时间扩散到组织中。

• 考虑在分析中引入损伤评分系统，以评估冰损伤是否影响实验结果。 

自由浮动部分的粗暴处理

• 使用网等设备可以帮助减少整个协议中组织切片所需的处理量。

• 使用优质细画笔拾取和移动部分。确保没有被低温恒温器/切片机刀片降解。

• 安装自由浮动部分时，尽量避免接触部分，而是使用刷子飘到载玻片上。

因储存不当而降解

• 如果保存不当，切片可能会被微生物生长污染。考虑使用 0.05% 叠氮hua钠来防止储存溶液或冷冻切片中的生长

抗原修复过于苛刻

• 考虑将抗原修复方法改为不太苛刻的方法

冰冻切片从载玻片上脱落

• 确保始终对载玻片进行处理，以确保切片更有效地粘贴。虽然有商业品种，但可以按照CSH 协议等既定协议在实验室中对载玻片进行替换； 

固定不佳

• 不全固定会导致组织迅速降解。尝试增加组织与固定剂一起孵育的时间或考虑增加固定剂的浓度。

高背景或非特异性染色

组织切片中的自荧光分子

• 如果组织尚未灌注，请考虑在下一个实验中进行，因为剩余的红细胞会产生强烈的自发荧光。

• 自发荧光可能是由固定剂引起的。尝试使用不同的固定剂。

• 确保 NaBH 4是新鲜制备的

• 尝试用淬灭荧光的染料（例如，Pontamine 天蓝、苏丹黑或台盼蓝）孵育切片。

• 尝试使用与自发荧光波长不同的荧光团（例如红移染料，如 Alexa Fluor 680） 

非特异性二次结合

• 运行无初级对照以评估次级对照是否与组织切片结合。

• 如果一抗与组织来自同一物种，这可能会导致重大问题。请参阅本协议或考虑使用不同种类的一抗。 

一抗浓度过高

• 尝试降低一抗浓度

二抗浓度过高

• 尝试降低二抗的浓度。我们发现 1:300 至 1:500 的稀释度是一个不错的起点。

抗体纯化不充分

• 未纯化的多克隆抗体可能含有与一系列非靶蛋白发生交叉反应的抗体。检查数据表；理想情况下，应使用免疫原作为诱饵，通过亲和层析纯化多克隆抗体。 

• 虽然单克隆抗体的问题较少见，但仍应至少使用 Protein A 或 G 亲和层析进行纯化。

• 如果有其他替代品，请考虑改用更好的纯化抗体，或者如果没有其他替代品，请考虑内部纯化抗体。  

阻挡不足

• 确保封闭血清与培养二抗的物种相同。

• 尝试使用不同的阻塞解决方案。

• 尝试增加封闭步骤的长度或增加血清浓度

洗涤不足

• 尝试增加洗涤的时间和/或次数。

• 确保洗涤期间有足够的搅拌，以帮助未结合的抗体扩散出组织

一抗与组织切片来自同一物种。

• 运行无初级对照以评估次级对照是否与组织切片结合。

• 如果一抗与组织来自同一物种，这可能会导致重大问题。请参阅本协议第 4.3 节或考虑使用不同种类的一抗。

内源酶活性（用于显色检测）

• 尝试用特定抑制剂阻断内源酶活性。

对于 HRP 结合二抗，使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分钟。如果在此浓度下封闭不成功，请考虑增加至 3%。 

对于 AP 结合二抗，请使用 2mM 左旋咪唑。 

部分已经干了

• 确保切片始终保持湿润，并在加湿室中使用载玻片安装方案进行长时间孵育。

底物过多（用于显色检测）

• 尝试降低底物浓度或孵育时间。

信号放大率过高（如果使用生物素化二抗）

• 尝试降低扩增试剂或二抗的浓度。

• 考虑信号放大是否必要或者标准方法是否有效。

组织切片厚度

• 组织切片越厚，宽视野显微镜中的散射光越多。尝试使用更薄的开关部分或共焦显微镜。