高质量的组织制备对于高质量的免疫组织化学结果绝对必要，因此始终值得花时间确保按照尽可能高的标准进行，以避免令人失望的结果。根据实验要求，组织可能需要新鲜使用或固定。

1 冷冻组织以供后续处理

有时需要在进一步处理或随后的固定之前冷冻组织。如果冷冻不当，可能会形成冰晶，损害细胞结构。通过正确冷冻，这将保持组织的质量，从而最大限度地提高免疫染色成功的机会。

1. 将装有异戊烷的烧杯（长烧杯中至少 500ml）在 -80°C 中或使用干冰预冷至 -42°C 至 -45°C 之间。定期监测温度以确保温度保持在这个范围内。

2. 在冰上使用干净的工具解剖组织。

3. 将纸巾放在铝箔上，并用滤纸除去多余的液体。

4. 将组织（不含铝箔）轻轻浸入异戊烷中。冷冻所需时间取决于组织样本大小，但冷冻成年大鼠大脑大约需要 5 分钟。

5. 在从异戊烷中取出组织之前，预冷镊子。将冷冻组织放入装有软纸巾的预冷管中。

6. 储存于-80°C 直至下次使用。

2 灌注固定

一般来说，当动物被灌注固定时，可以获得最佳质量的组织切片。该过程涉及先用缓冲液然后用固定剂替换血液，并且其具有高自发荧光。在尝试之前，请确保您的监管制度涵盖了这一点，并获得经验丰富的从业人员的培训。针对啮齿类动物的一般方案是：

1. 通过适当途径过量注射麻醉剂，直至动物没有脚趾捏和眨眼反射但心脏仍在跳动。

2. 打开胸腔，露出心脏，剪断右心房。将针插入左心室，并通过冰冷的 PBS（大鼠约 200ml，小鼠约 15ml）灌注，然后灌注类似体积的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。

3. 取出大脑/其他器官，放入装有 4% 多聚甲醛的小瓶中，在 4°C 下放置 24 小时。

4. 将组织移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中，直至组织沉入小瓶底部

3 浸入固定

对于小体积的组织，通常用固定剂孵育组织就足够了，而不是使用灌注固定。然而，这将导致较高的背景，因为血液不会从小毛细血管中去除。

1. 在冰上用干净的工具解剖组织。

2. 用冰冷的 PBS 短暂清洗

3. 将组织放入含 4% 多聚甲醛的 PBS 中，4°C 下放置 24 小时

4. 将组织移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中，直至组织沉入小瓶底部

4 切片

可以在一系列机器上切割切片，最常见的是低温恒温器和冷冻切片机。机器的选择部分取决于可用性，部分取决于需要切割多厚的部分。检查可用机器的规格是否与所需的截面厚度相匹配。

对于载玻片免疫组织化学，切片可以直接切割到显微镜载玻片上，或者切割到 PBS 中，用于自由浮动免疫组织化学。

切割后，切片可以冷冻以供日后处理：

• 载玻片安装：让切片干燥后，切片可在 -20°C 至 -80°C 下保存长达一年

• 自由浮动 将切片转移至冷冻保护剂中，然后在 -20°C 下保存长达一年。