原位杂交（红色荧光单标）

一.项目介绍：

1. 原位杂交原理：原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。

2. 所需器材：

脱水机G-JT12s，包.埋机G-L5/p5,病理切片机RM2016，冻台G-P1，烤箱GFL-70/230,组织摊片机G-KDP，载玻片及盖玻片，正置荧光显微镜，成像系统，恒温箱，高压灭菌锅，移液枪，钟摆摇床。

3. 主要试剂：DEPC。原位杂交固定液。PBS缓冲液。20×SSC洗脱液。蛋白酶K。DAPI。抗荧光淬灭封片剂。杂交液。

 二.石蜡切片荧光探针原位杂交实验步骤

1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化    min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

6、预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

7、杂交：倾去预杂交液，滴加含探针     杂交液, 浓度    ，恒温箱     度杂交过夜。

8、杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

9、DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

10.镜检拍照：切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm,发蓝光；FAM(488)绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。）DAPI染核，为蓝光。

注意事项：

1.mRNA为检测对象时，需严格要求实验环境经无RNA酶处理。

2.FISH切片保存时间较短，应尽快取图。

原位杂交（红色荧光单标）

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