通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物（膜），通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。可检测到低至1～5ng（Low可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。

实验结果展示：

WB（普通蛋白,磷酸化蛋白)实验流程：

　　 Western Blot实验步骤

        1、 细胞总蛋白提取

      （1）对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul  RIPA（在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。

      （2） 对于贴壁细胞:

        ① 用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次*吸干残留液。

        ② 加入适当体积的 RIPA（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。

        ③ 用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。

      （3） 冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞*裂解。

      （4） 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

        2、 组织蛋白提取：

      （1） 组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上*匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。

      （2） 将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞*裂解。

      （3） 12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。

        3、 蛋白浓度测定：BCA法侧蛋白浓度

        4、 SDS-PAGE电泳

      （1） 清洗玻璃板

      （2）灌胶与上样

        ① 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

        ② 按实验安排配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

     分离胶配比

 ③ 按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

（3） 加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

5 转膜  （小于20kd的蛋白请使用0.22um的PVDF膜。）

（1）准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。

（2） 在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。

（4）小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并除气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。

（5）转膜条件（湿转）

 ① 快转。300mA恒流转膜半小时，或者200mA转膜1小时，时间可以略微调整，时间对应调整。

 ② 慢转。转膜过夜，25V恒压转膜过夜。

  6 免疫反应

 ① 将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)，封闭1h。

 ① 稀释一抗（TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育过夜（快转），或者4℃孵育抗体3小时（慢转）。

 ③用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min

 ④ 将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min

  7 化学发光 将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1-2min后，去尽残液，包好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的光强度调整曝光条件。

  8 凝胶图像分析 将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

蛋白样品制备的注意事项：

     1、细胞数量达5×106

     2、将细胞裂解液再离心，收集上清液，加loading煮样5min。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：

    1、做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶（水封、插梳子和拔梳子）

    2、加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散。

    3、电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到90V开始电泳。

转膜注意事项：

     1、泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min。（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

    2、转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板

    3、转膜条件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中进行转膜（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短）

    4、避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

    5、夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不*。

    6、保证膜和滤纸的大小和凝胶*一样，过大和过小都会影响转膜效率。

    7、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）

关于磷酸化蛋白检测的注意事项：

   1、保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！

   2、使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉！（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景）。

抗体保存注意事项：

  1、收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存！

  2、对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃

（1）分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10μl每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。

（2）复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再冻起来！

（3） 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。

  3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

  4、长期保存，加入叠氮钠，防止细菌污染。