周细胞收缩是动脉狭窄充血过程中毛细血管收缩的基础
时间：2022-06-01 阅读：464
冠状动脉充血阶段，狭窄远端的毛细血管“去募集”（de-recruitment）被认为是发生可逆灌注缺陷和潜在心肌缺血的原因，但潜在机制尚不明确。为探究狭窄条件下充血时，周细胞收缩是否是毛细血管去募集的原因。美国研究人员Carmen Methner等使用双光子显微镜（2PM）和光学显微血管造影术（OMAG），活体内测量了股动脉狭窄的野生型和周细胞缺失小鼠中，充血引发的毛细血管直径和灌注变化。结果证明动脉狭窄情况下充血刺激产生的毛细血管收缩与红细胞流量减少相关，此外充血引发的毛细血管直径变化优先发生在有周细胞的毛细血管段。进一步使用周细胞部分缺失小鼠模型中证实，动脉狭窄情况下，充血后毛细血管收缩量也显著低于对照组。这些结果shouci在活体内直接观察了动脉狭窄远端由充血引发的毛细血管“去募集”现象，并证明了周细胞收缩这一现象的基础，对运动性缺血有重要的治疗意义。研究成果以“Pericyte constriction underlies capillary de-recruitment during hyperemiain the setting of arterial stenosis”为题发表于Heartand Circulatory Physiology。
背景
在冠状动脉狭窄情况下，当冠状动脉灌注压下降时，动脉自动调节和侧支血流会组合维持静息的毛细血管静水压（CHP）和心肌血流。然而运动或药物引起的充血会在狭窄下游组织中引起可逆的灌注缺陷，特征为毛细血管血容量减少和血管阻力增加。这种现象被称为毛细血管“去募集”（de-recruitment），充血阶段通过动脉狭窄处的血流增加，导致冠状动脉灌注压下降，毛细血管去募集似乎可以维持该情况下的CHP，虽然代价是可能有心肌缺血的风险，而目前毛细血管去募集的细胞机制尚不明确。
通常认为毛细血管是血流调节中的被动参与者，因为缺乏可收缩的血管平滑肌细胞。然而对脑和视网膜的研究表明，周细胞（微脉管系统中的收缩性壁细胞）可在毛细血管水平上调节血流。药物或电刺激周细胞会使毛细血管收缩。此外，周细胞介导的毛细血管直径变化还参与功能性充血期间脑血流的生理调节，以及实验性脑缺血后血流的病理性限制。
假设存在动脉狭窄的情况下，充血期间周细胞与毛细血管的去募集有关。由于目前无法以单个细胞分辨率对冠状动脉微循环进行活体内动态成像，研究人员使用双光子显微镜（2PM）和光学显微血管造影术（OMAG）对小鼠骨骼肌中的毛细血管去募集进行了直接可视化。使用周细胞表达红色荧光蛋白的NG2-DsRed转基因小鼠使周细胞可视化。使用周细胞部分缺失（partial pericyte depletion, PPD）小鼠测试周细胞在毛细血管收缩中的必要性，PPD表型由血小板源生长因子受体β基因中7个点突变产生（PdgfrβF7/F7），导致周细胞退化。
结果
实验性动脉狭窄模型如图1A。动脉狭窄导致激光多普勒测得血流瞬间减少，但在3-4min内回到基线水平（图1B，n = 5）。股动脉局部注射6 mM腺苷制造充血后，对照组血流量增加到约为基线的150%，而存在狭窄的情况下该充血反应被消除（图1C，n = 5-8；P < 0.001）。这种维持正常静息血流并*消除充血反应与严重动脉狭窄标准相符合。
图1股动脉实验性狭窄。（A）骨骼肌图像，表明狭窄位置（虚线方框）、股动脉（箭头）和成像位置（虚线圈）。（B）激光多普勒血流仪显示，股动脉血流在最初的诱导狭窄时降低后，恢复到基线水平。（C）对照组中，腺苷（6mM）使股动脉血流增加，而狭窄情况下该充血应答被消除了。
01-严重动脉狭窄情况下，充血会导致毛细血管收缩和去募集
以1min为间隔采集红细胞血流的OMAG图像（图2A），使用血管造影扫描验证成像位置的稳定。对照组中，充血使红细胞流量增加（图2B，对比黑色[基线]与蓝色[充血后5min]），而狭窄情况下，充血使红细胞流量显著降低（图2B，对比橙色[基线]与红色[充血后5min]；每组n = 6-8；P < 0.001）。
通过绘制流量图像中零值像素的减少或增加（零值表示没有流量），评估毛细血管的募集或去募集（图2C）。发现对照组中，充血后红细胞流量增加，同时零值像素数量减少，提示毛细血管募集（图2C黑线和蓝线；每组n = 6-8；处理与对照的相对比率= 0.966，95% CI= [0.962，0.971]，P < 0.001）。相比之下，狭窄组中充血引发的红细胞流量下降伴随着零值像素数量增加，对应腺苷给药后20min内持续存在的毛细血管去募集（图2C橙色与红色；每组n = 6；相对变化率= 1.066，95% CI= [1.017，1.118]，P =0.0080）。
接下来静脉注射荧光示踪剂FITC-葡聚糖后，每隔40s使用2PM对血管床成像，评估毛细血管直径变化。使用IMARIS软件中的Filaments模块测量成像框架内所有毛细血管段的直径（图2D）。对照组制造充血后，平均毛细血管段直径短暂增加，但在1-2min内恢复到基线。狭窄组充血引发血管直径短暂下降，随后缓慢正常化（P = 0.04）。充血后前5min内毛细血管直径变化的分布图显示出显著左移，表明与对照组相比，狭窄组收缩性毛细血管增加（图2E，P = 0.003）。对照组中，充血使26±5%的毛细血管扩张（直径增加> 5%），19±3%的毛细血管收缩（直径减少＞5%）。狭窄组中，充血仅使14±4%的毛细血管扩张，32±4%的毛细血管收缩（图2E-F；P = 0.049）。
尽管因充血而扩张和收缩的毛细血管段不同（图2E-F），但动脉狭窄情况下，收缩段数量更多，导致毛细血管网直径整体减小。因此，红细胞流量的可视化和整个微血管网络中毛细血管直径的直接测量表明，动脉狭窄情况下，充血会导致毛细血管发生去募集，而这主要由毛细血管收缩引起。
图2 狭窄情况下，充血使毛细血管发生去募集。（A）用于定位的血管造影图。（B）基线（0min）和腺苷（6mM）处理充血后5min表层毛细血管中的红细胞流量。实线为每个实验组动物间的平均计数，点为单个数据。柱形为t=0和5min对照和狭窄组像素计数的平均差。（C）与对照组相比，狭窄组充血后零值像素数量增加，反应了毛细血管去募集。（D）使用2PM在静脉注射FITC-葡聚糖的NG2-DsRed小鼠中体内评估毛细血管直径变化。（E）充血后血管直径变化。（F）充血后收缩扩张比率。
02-毛细血管“去募集”与周细胞相关毛细血管的收缩有关
对骨骼肌微血管床进行可视化（图3A），根据是否与周细胞胞体相关（图3B）、是否与周细胞突起相关，或二者都不相关（图3C）对毛细血管段分类。
使用周细胞收缩剂ATP作阳性对照，以证实使用2PM可以检测到周细胞收缩。ATP在周细胞相关的毛细血管段中诱发了明显的收缩（图3D，n = 10，P = 0.001），但在没有周细胞关联的血管中没有变化（图3E，n = 10，P = 0.10）。接下来测试狭窄情况下充血后的毛细血管收缩是否与周细胞相关。结果发现狭窄情况下，在有周细胞的毛细血管段中，充血引起收缩数量增加、扩张数量减少（图3F，n = 12，P = 0.04），但在没有周细胞的血管段中没有变化（图3G，n = 12，P = 0.36）。
图3存在周细胞的位置发生毛细血管收缩。（A）使用2PM对NG2-DsRed小鼠骨骼肌微血管的活体可视化。以有（B）或无（C）周细胞存在划分血管段。（D）与盐水对照相比，局部ATP（1-10mM）处理会使含周细胞的血管段的直径显著左移，偏向收缩。（E）缺乏周细胞的毛细血管段并未对ATP做出改变应答。（F）狭窄情况下，充血引发有周细胞的毛细血管段偏向收缩。（G）缺乏周细胞的毛细血管段对充血的反应没有差异。
03-周细胞缺失阻碍了毛细血管的去募集
使用PPD小鼠确定周细胞在介导毛细血管去募集行为中的作用，DDP是一种转基因品系，由于Pdgfrβ突变使得周细胞部分但显著减少。通过PDGFRβ免疫荧光标记识别周细胞、荧光异凝集素B4（isolectin B4）标记血管，证实了PPD小鼠周细胞较少。在PPD小鼠骨骼肌中，与野生型同窝对照相比，带有PDGFRβ阳性周细胞的、等异凝集素标记的血管结构的覆盖率减少了45%（图4A，PPD小鼠中占总血管的37±4%，野生型69±4%，P < 0.001）。
接下来测试PPD和野生同窝对照组小鼠毛细血管的收缩能力。ATP诱导对照中45±4%的毛细血管收缩，PPD组中仅27±4%（图4B，n = 6-8，P = 0.04），相比减少了约40%。相反，ATP诱导对照组中24±5%的毛细血管扩张，而PPD组显著增多，为44±6%（n = 6-8，P = 0.02）。已知ATP诱导的毛细血管收缩依赖于周细胞，因此这些结果与PPD 小鼠的周细胞功能相关联。
动脉狭窄情况下，与对照相比，PPD小鼠充血时收缩毛细血管段的比例显著降低（图4C，野生型33±4%，PPD小鼠14±3%，n = 6-8，P 311 = 0.04）。这些发现证实动脉狭窄情况下，周细胞缺失阻碍了毛细血管的去募集。
图4 周细胞缺失阻止了动脉狭窄情况下的毛细血管去募集。（A）PPD及对照小鼠中，PDGFRβ免疫荧光（红色）和异凝集素B4标记的毛细血管（绿色）。（B）与对照相比，ATP使PPD小鼠毛细血管应答右移、收缩血管段数量减少。（C）动脉狭窄情况下，PPD小鼠毛细血管对充血的应答右移，偏向扩张，表明收缩血管段数量减少。
结论
本研究直接活体观察了小鼠骨骼肌在动脉狭窄情况下毛细血管的“去募集”现象，并进一步证明了该现象是周细胞使毛细血管收缩所致。表明周细胞是毛细血管血流量和静水压的关键调节因子。虽然还存在一些局限性，如使用骨骼肌而不是心脏血管，股动脉床的血液供应与冠状动脉床有些不同；尚不清楚狭窄情况下，血管对充血的舒缩反应是否由周细胞单独决定、是否需要内皮细胞参与，这也是后续研究的一个重要方向。本研究的数据依然很有价值，在冠状动脉缺血治疗处理中，阻碍周细胞收缩可作为防止组织损伤的新治疗方法。
背景
在冠状动脉狭窄情况下，当冠状动脉灌注压下降时，动脉自动调节和侧支血流会组合维持静息的毛细血管静水压（CHP）和心肌血流。然而运动或药物引起的充血会在狭窄下游组织中引起可逆的灌注缺陷，特征为毛细血管血容量减少和血管阻力增加。这种现象被称为毛细血管“去募集”（de-recruitment），充血阶段通过动脉狭窄处的血流增加，导致冠状动脉灌注压下降，毛细血管去募集似乎可以维持该情况下的CHP，虽然代价是可能有心肌缺血的风险，而目前毛细血管去募集的细胞机制尚不明确。
通常认为毛细血管是血流调节中的被动参与者，因为缺乏可收缩的血管平滑肌细胞。然而对脑和视网膜的研究表明，周细胞（微脉管系统中的收缩性壁细胞）可在毛细血管水平上调节血流。药物或电刺激周细胞会使毛细血管收缩。此外，周细胞介导的毛细血管直径变化还参与功能性充血期间脑血流的生理调节，以及实验性脑缺血后血流的病理性限制。
假设存在动脉狭窄的情况下，充血期间周细胞与毛细血管的去募集有关。由于目前无法以单个细胞分辨率对冠状动脉微循环进行活体内动态成像，研究人员使用双光子显微镜（2PM）和光学显微血管造影术（OMAG）对小鼠骨骼肌中的毛细血管去募集进行了直接可视化。使用周细胞表达红色荧光蛋白的NG2-DsRed转基因小鼠使周细胞可视化。使用周细胞部分缺失（partial pericyte depletion, PPD）小鼠测试周细胞在毛细血管收缩中的必要性，PPD表型由血小板源生长因子受体β基因中7个点突变产生（PdgfrβF7/F7），导致周细胞退化。
结果
实验性动脉狭窄模型如图1A。动脉狭窄导致激光多普勒测得血流瞬间减少，但在3-4min内回到基线水平（图1B，n = 5）。股动脉局部注射6 mM腺苷制造充血后，对照组血流量增加到约为基线的150%，而存在狭窄的情况下该充血反应被消除（图1C，n = 5-8；P < 0.001）。这种维持正常静息血流并*消除充血反应与严重动脉狭窄标准相符合。
图1股动脉实验性狭窄。（A）骨骼肌图像，表明狭窄位置（虚线方框）、股动脉（箭头）和成像位置（虚线圈）。（B）激光多普勒血流仪显示，股动脉血流在最初的诱导狭窄时降低后，恢复到基线水平。（C）对照组中，腺苷（6mM）使股动脉血流增加，而狭窄情况下该充血应答被消除了。
01-严重动脉狭窄情况下，充血会导致毛细血管收缩和去募集
以1min为间隔采集红细胞血流的OMAG图像（图2A），使用血管造影扫描验证成像位置的稳定。对照组中，充血使红细胞流量增加（图2B，对比黑色[基线]与蓝色[充血后5min]），而狭窄情况下，充血使红细胞流量显著降低（图2B，对比橙色[基线]与红色[充血后5min]；每组n = 6-8；P < 0.001）。
通过绘制流量图像中零值像素的减少或增加（零值表示没有流量），评估毛细血管的募集或去募集（图2C）。发现对照组中，充血后红细胞流量增加，同时零值像素数量减少，提示毛细血管募集（图2C黑线和蓝线；每组n = 6-8；处理与对照的相对比率= 0.966，95% CI= [0.962，0.971]，P < 0.001）。相比之下，狭窄组中充血引发的红细胞流量下降伴随着零值像素数量增加，对应腺苷给药后20min内持续存在的毛细血管去募集（图2C橙色与红色；每组n = 6；相对变化率= 1.066，95% CI= [1.017，1.118]，P =0.0080）。
接下来静脉注射荧光示踪剂FITC-葡聚糖后，每隔40s使用2PM对血管床成像，评估毛细血管直径变化。使用IMARIS软件中的Filaments模块测量成像框架内所有毛细血管段的直径（图2D）。对照组制造充血后，平均毛细血管段直径短暂增加，但在1-2min内恢复到基线。狭窄组充血引发血管直径短暂下降，随后缓慢正常化（P = 0.04）。充血后前5min内毛细血管直径变化的分布图显示出显著左移，表明与对照组相比，狭窄组收缩性毛细血管增加（图2E，P = 0.003）。对照组中，充血使26±5%的毛细血管扩张（直径增加> 5%），19±3%的毛细血管收缩（直径减少＞5%）。狭窄组中，充血仅使14±4%的毛细血管扩张，32±4%的毛细血管收缩（图2E-F；P = 0.049）。
尽管因充血而扩张和收缩的毛细血管段不同（图2E-F），但动脉狭窄情况下，收缩段数量更多，导致毛细血管网直径整体减小。因此，红细胞流量的可视化和整个微血管网络中毛细血管直径的直接测量表明，动脉狭窄情况下，充血会导致毛细血管发生去募集，而这主要由毛细血管收缩引起。
图2 狭窄情况下，充血使毛细血管发生去募集。（A）用于定位的血管造影图。（B）基线（0min）和腺苷（6mM）处理充血后5min表层毛细血管中的红细胞流量。实线为每个实验组动物间的平均计数，点为单个数据。柱形为t=0和5min对照和狭窄组像素计数的平均差。（C）与对照组相比，狭窄组充血后零值像素数量增加，反应了毛细血管去募集。（D）使用2PM在静脉注射FITC-葡聚糖的NG2-DsRed小鼠中体内评估毛细血管直径变化。（E）充血后血管直径变化。（F）充血后收缩扩张比率。
02-毛细血管“去募集”与周细胞相关毛细血管的收缩有关
对骨骼肌微血管床进行可视化（图3A），根据是否与周细胞胞体相关（图3B）、是否与周细胞突起相关，或二者都不相关（图3C）对毛细血管段分类。
使用周细胞收缩剂ATP作阳性对照，以证实使用2PM可以检测到周细胞收缩。ATP在周细胞相关的毛细血管段中诱发了明显的收缩（图3D，n = 10，P = 0.001），但在没有周细胞关联的血管中没有变化（图3E，n = 10，P = 0.10）。接下来测试狭窄情况下充血后的毛细血管收缩是否与周细胞相关。结果发现狭窄情况下，在有周细胞的毛细血管段中，充血引起收缩数量增加、扩张数量减少（图3F，n = 12，P = 0.04），但在没有周细胞的血管段中没有变化（图3G，n = 12，P = 0.36）。
图3存在周细胞的位置发生毛细血管收缩。（A）使用2PM对NG2-DsRed小鼠骨骼肌微血管的活体可视化。以有（B）或无（C）周细胞存在划分血管段。（D）与盐水对照相比，局部ATP（1-10mM）处理会使含周细胞的血管段的直径显著左移，偏向收缩。（E）缺乏周细胞的毛细血管段并未对ATP做出改变应答。（F）狭窄情况下，充血引发有周细胞的毛细血管段偏向收缩。（G）缺乏周细胞的毛细血管段对充血的反应没有差异。
03-周细胞缺失阻碍了毛细血管的去募集
使用PPD小鼠确定周细胞在介导毛细血管去募集行为中的作用，DDP是一种转基因品系，由于Pdgfrβ突变使得周细胞部分但显著减少。通过PDGFRβ免疫荧光标记识别周细胞、荧光异凝集素B4（isolectin B4）标记血管，证实了PPD小鼠周细胞较少。在PPD小鼠骨骼肌中，与野生型同窝对照相比，带有PDGFRβ阳性周细胞的、等异凝集素标记的血管结构的覆盖率减少了45%（图4A，PPD小鼠中占总血管的37±4%，野生型69±4%，P < 0.001）。
接下来测试PPD和野生同窝对照组小鼠毛细血管的收缩能力。ATP诱导对照中45±4%的毛细血管收缩，PPD组中仅27±4%（图4B，n = 6-8，P = 0.04），相比减少了约40%。相反，ATP诱导对照组中24±5%的毛细血管扩张，而PPD组显著增多，为44±6%（n = 6-8，P = 0.02）。已知ATP诱导的毛细血管收缩依赖于周细胞，因此这些结果与PPD 小鼠的周细胞功能相关联。
动脉狭窄情况下，与对照相比，PPD小鼠充血时收缩毛细血管段的比例显著降低（图4C，野生型33±4%，PPD小鼠14±3%，n = 6-8，P 311 = 0.04）。这些发现证实动脉狭窄情况下，周细胞缺失阻碍了毛细血管的去募集。
图4 周细胞缺失阻止了动脉狭窄情况下的毛细血管去募集。（A）PPD及对照小鼠中，PDGFRβ免疫荧光（红色）和异凝集素B4标记的毛细血管（绿色）。（B）与对照相比，ATP使PPD小鼠毛细血管应答右移、收缩血管段数量减少。（C）动脉狭窄情况下，PPD小鼠毛细血管对充血的应答右移，偏向扩张，表明收缩血管段数量减少。
结论
本研究直接活体观察了小鼠骨骼肌在动脉狭窄情况下毛细血管的“去募集”现象，并进一步证明了该现象是周细胞使毛细血管收缩所致。表明周细胞是毛细血管血流量和静水压的关键调节因子。虽然还存在一些局限性，如使用骨骼肌而不是心脏血管，股动脉床的血液供应与冠状动脉床有些不同；尚不清楚狭窄情况下，血管对充血的舒缩反应是否由周细胞单独决定、是否需要内皮细胞参与，这也是后续研究的一个重要方向。本研究的数据依然很有价值，在冠状动脉缺血治疗处理中，阻碍周细胞收缩可作为防止组织损伤的新治疗方法。
参考文献：Methner, C. , et al. "Vascular Biology and Microcirculation: Pericyte constriction underlies capillary derecruitment during hyperemia in the setting of arterial stenosis." American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology 317.2.