iElisa 玉米赤霉烯酮检测试剂盒

iElisa 玉米赤霉烯酮检测试剂盒

1. 概要 iElisa 玉米赤霉烯酮检测试剂盒利用竞争性酶 联免疫反应原理，对玉米、麦类、豆类、大米等谷 物和饲料中玉米赤霉烯酮的含量进行定量检测。玉 米赤霉烯酮是由镰刀菌类的真菌形成，它是一种植 物性激素，并具雌激素性特征。玉米赤霉烯酮具有 较强的生殖毒性和致畸作用，可引发动物发生雌性 激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家畜特别是 猪、牛和羊的影响较大。中国标准规定：玉米、小 麦中玉米赤霉烯酮不得超过 60μg /kg，配合饲料、 饲料原料玉米中玉米赤霉烯酮不得超过 500μg /kg。 2. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 抗抗体。加入玉米赤霉烯酮（ZEN）标准品或样品、 酶标抗原和抗体后，游离的玉米赤霉烯酮与酶标抗 原竞争结合抗体，抗体或抗体结合物与固定在微孔 板上的抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗 原及抗体被洗去，加入 TMB 底物显蓝色，加入终 止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在 450nm 处检测， 吸光值与样品中玉米赤霉烯酮含量成负相关，与标 准曲线比较即可得出玉米赤霉烯酮的含量。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条 ×8 孔） 2) 玉米赤酶烯酮标准品：0 ng/ml 、0.5ng/ml、 2.0ng/ml、5.0ng/ml、15.0ng/ml、50.0ng/ml； 1 瓶 × 1.0ml 3) ZEN酶标抗原： 1 瓶 ×10ml 4) ZEN抗体： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 6) ZEN稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50ml 7) ZEN稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50ml 8) 显色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 9) 终止液： 1 瓶 × 7ml 10) 试剂盒说明书： 1 份 11) 质检报告： 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —样品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 纯水，混匀。 —纯水（蒸馏水、去离子水） 5. 样品处理 5.1 谷物（玉米、小麦、大麦、大米、大豆）： 1） 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 15 分钟（或使用高速均质器均质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟），静置 5 分钟。 2） 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 300μl ZEN 稀释缓冲 液 A，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：20 5.2 饲料： 1) 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 15 分钟（或使用高速均质器均 质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟），静置 5 分 钟。 2) 将提取液用普通滤纸过滤，测 pH 值，如果不 在 pH6-8 范围内，请用酸或碱进行调整。 3) 吸取 20μl 滤液置于 1.5ml 离心管中，加入 380ul ZEN 稀释缓冲液 B，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：1005.3 尿液样品： 1) 取 5ml 待检样品于 15ml 离心管中，3000r/min， 离心 10 分钟 2) 吸取 100μl 离心后澄清样品置于 1.5ml 离心管 中 3) 加入 400μl ZEN 稀释缓冲液 A，用涡旋混合器 混匀。 稀释倍数：5 5.4 饲料（高灵敏度）： 4) 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 15 分钟（或使用高速均质器均 质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟），静置 5 分 钟。 5) 将提取液用普通滤纸过滤，测 pH 值，如果不 在 pH6-8 范围内，请用酸或碱进行调整。 6) 吸取 50μl 滤液置于 1.5ml 离心管中，加入 200ul ZEN 稀释缓冲液 B，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：25 5.5 植物油（花生油、玉米油、大豆油、芝麻油、 橄榄油等）： 1) 称取 5.0g 样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转混合器 上振荡 15 分钟（或使用高速均质器均质 3 分 钟，或摇床上振荡 40 分钟），静置 5 分钟。 2) 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 300μl ZEN 稀释缓冲 液 C，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：20 5.6 塘渣样品： 1) 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 15 分钟（或使用高速均质器均 质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟），静置 5 分 钟。 2) 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 300μl ZEN 稀释缓冲 液 C，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：20 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制: 根据实验所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用纯水、或蒸馏水、去离子 水） 2) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 浓缩液+90 ml 纯 水, 可以用于 32 孔的检测）。 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 标准品或样品分别加至相应的微孔 （双孔）中，然后各加入 50μl 的 ZEN 酶标抗 原，再加入 50μl 的 ZEN 抗体，加盖，在室温 温育 30 分钟（每个标准品和样品必须使用新 的吸头）。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μl 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 4) 每孔加入150μl底物，室温避光温育10分钟。 5) 每孔加入50μl 终止液。 6) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以玉米赤霉烯酮标准品浓度值（ppb）为 X 轴， 百分吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每 一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专 业软件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应的稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 试剂盒的性能指标 1) 检测限 LOD: 谷物 5ppb（μg /kg），饲料 50ppb(15ppb),尿液 3.0ppb，植物油 5ppb（μg /kg）。（LOD：空白样品测定值+2 倍标准偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 10ppb，饲料 100ppb(20ppb), 尿液 5.0ppb，植物油 20ppb。 3) 定 量 检 测 范 围 ： 谷 物 10-1000ppb ， 饲 料 100-5000ppb（20-1200ppb）, 尿液 5-250ppb， 植物油 20-1000ppb。