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 -BIA Separations！让病毒纯化更高效

前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。
 

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。
 

首先纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；
 

第二步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
 

两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。

​​​​​​​   AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

​​​​​​​   在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。 

​​​​​​​   随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。

层析条件
 

*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
 

层析方法
 

1.  用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2.  将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3.  将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5.  用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6.  用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7.  用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线

​​​​​​​    在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从        超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

​​​​​​​ ​​​​​​​   为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。 

​​​​​​​ ​​​​​​​   该步骤进一步去除了杂质。

层析条件

*2 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
 

层析方法

1.  调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。

3.  将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。

4.  用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。

5.  用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。

7.  加样 3 次后，对柱子进行清洗。

图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA

·  从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵，必须在生物应用质粒之前将其除去。

·  缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。

·  配置和填充可能需要额外的处理。
 

二步法层析过程分析：

​​​​​​​    质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法，确保最终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

​​​​​​​​​​   CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物（开环和线性 pDNA），去除杂质（RNA），并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。

​​​​​​​   ​​​​​​​CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。

图 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的质粒 DNA 亚型含量的质量控制

结果和结论：
 

​​​​​​​ ​​​​​  通过优化裂解、沉淀和两种色谱步骤相结合，可生产满足所有监管要求的纯 pDNA。

​​​​​​​ ​​​​​​​  可以完成去除 99% 以上的主要杂质（RNA，基因组 DNA，宿主细胞蛋白，内毒素和开环 pDNA）。

​​​​​​​ ​​​​​​​  此外，快速（大肠杆菌的 pDNA 提取和纯化可在几小时内完成），可重复的过程可降低运营成本并提高工厂生产率。 

​​​​​​​ ​​​​​​​  *的整体特性有助于该过程的直接可扩展性，涵盖从小规模实验室到大规模工业纯化 pDNA 的生产水平。

Table 1: Process results.

点评 
 

目前市面上有不少质粒纯化工艺方案，但是比较下来，BIA 二步法纯化工艺具有两大优势：
 

​​​​​​​  效率明显提高

只需两步色谱和高流速的整体柱色谱方案，减少工艺步骤（提高回收率）并加快纯化速度，从而显著提高生产率。
 

​​​​​​​   灵活放大

由于特定的整体柱设计，质粒 DNA 过程可以快速扩展到更大的单位。 

在 1 毫升色谱柱上设计的工艺可以轻松转移到试验和生产规模。

在 8L 色谱柱上单次运行可以产生 48 g 药物级 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

十多年来，BIA Separations 一直是高效率质粒纯化的好选择。它不仅提供整体柱和平台模板，还提供定制的纯化服务，以*您的质粒 DNA 纯化需求

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