PPB即表示与血浆蛋白结合形成结合态药物的比例。游离药物假说认为仅有游离态的药物才能扩散透过生物膜，到达靶部位发挥药效；另外游离药物的比例还显著影响药物分布、代谢和排泄的过程，PPB与药物的诸多药理性质均有关。

　　影响PPB测定的因素很多，如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等，需根据化合物的特征，结合研究的实际目的，选择合适的测定方法反应真实的化合物特性。需根据化合物预期治疗浓度，个性化的制定试验浓度，必要时进行不同浓度条件下的PPB测定。其中对于*蛋白结合率的化合物，试验的微小偏差即会对结果造成较大的相对偏差，此时还需要同步优化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等检测分析技术。

　　平衡透析法目前是常用的方法，但也存在一定的缺陷，如初始平衡状态的改变、非特异性结合、体积变换、Donnan效应和蛋白渗漏等。

　　初始平衡状态的改变是指当游离药物穿过半透膜时会形成新的游离态-结合态的平衡，由此造成试验设置浓度与实际平衡浓度的差异，对于PPB存在浓度依赖特性的化合物可能造成结果的偏差。

　　非特异性结合是指药物与半渗透膜等试验装置的结合，可能造成游离药物浓度的低估，进而影响试验结果。通常采用聚四氟乙烯(Teflon)制造的试验装置以降低非特异性结合的影响。如果非特异性结合现象比较严重建议采用超速离心法。

　　体积转换是指液体在胶体渗透压的作用下从buffer侧移动至蛋白侧，由此稀释蛋白浓度对结合率较低的化合物试验结果造成影响。当液体转换比例低于10%时该效应几乎忽略，孵育时间超过4h可能会加剧该效应，可以通过在buffer侧加入右旋糖酐以平衡两侧渗透压。

　　Donnan效应是指吉布斯-唐南效应，是指带电粒子不通过半透膜而产生不均匀的电荷，使两侧粒子浓度不一致。尤其对于高离子化且低蛋白结合的药物，该效应最为明显，该效应可以通过增加buffer侧电解质的浓度来弱化。

　　当半透膜完整性出现问题时会发生蛋白渗漏现象，对于高蛋白结合率化合物，由此会造成游离药物比例的显著高估，尤其在孵育时间过长时易发生。