在成人肌细胞收缩中的应用

该系统被理想化和开发以消除光学边缘检测和分割方法的局限性，例如在成人 CM 的采集过程中对适当的细胞对齐和细胞旋转的要求（Delbridge 和 Roos，1997 年；Ren 和 Wold ， 2001年） . 为了测试我们方法的有效性和敏感性，我们将细胞暴露于对收缩参数有明确影响的药物。成人 CM 接受异丙肾上腺素 (ISO) (100 nmol L -1 ) 或维拉帕米(VERA) (100 nmol L -1). 异丙肾上腺素是一种 β-肾上腺素能激动剂，通过增加平均速度和缩短长度的程度显着增强 CM 收缩力，从而减少收缩和松弛所需的时间（Butler 等人，2015 年；Harmer 等人，2012年）。维拉帕米是一种钙通道阻滞剂，广泛用于治疗心律失常（Bourgonje 等人，2013 年），同时也是一种抗高血压药，因为它在心脏系统中具有负性肌力和变时作用（Harmer 等人，2012 年；斯特恩等人，1986 年）。图 4Ai-ii 分别显示了样本空间图像和平均速度轨迹，这些记录是从以 1 Hz 刺激并用异丙肾上腺素或维拉帕米处理 60 秒的细胞记录的。图 4 Aiii 显示了从一个收缩-松弛周期获得的一条平均速度轨迹的放大视图。图 4 B–4D显示了来自三个立实验的异丙肾上腺素和维拉帕米对成人 CM 收缩参数影响的浓度响应分析。如图4 B所示，ISO 和 VERA 都减少了收缩和松弛时间，对松弛时间的影响更显着。此外，ISO 增加了大收缩和松弛速度（图 4 C）并缩短了面积（图 4D) 成人 CM 的浓度依赖性方式。当用 VERA 处理细胞时，观察到相反的效果（图 4C和 4D）。表 S1列出了用不同浓度的 ISO 和 VERA 处理的成人 CM 获得的所有收缩参数。值得注意的是，数据分析不需要用户操作图像，因为软件可以处理实验生成的整个图像。

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图 4。小鼠和 TGR-mREN2-27 大鼠成人 CM 收缩效应的收缩波运动和图形检测

(A) (i) 在大收缩速度 (MCS) 和大松弛速度 (MRS) 响应异丙肾上腺素 (100 nmol L ?1 ) 期间，成年小鼠 CM 细胞位移速度显示在幅度和矢量场中，具有视觉和数字强度标度检测或维拉帕米（100 nmol L -1）治疗。比例尺，20 微米。(ii) 从以 1 赫兹刺激收缩的 CM 记录的平均速度图。(iii) 在异丙肾上腺素或维拉帕米治疗对 CM 的影响下获得了一个单一的收缩-松弛周期。

(B) 用 ISO 和 VERA 进行急性处理会导致 CM 的所有时间参数显着降低。

(C–E) (C) 用 VERA 处理的细胞表现出 MCS 和 MRS 的减少，而 ISO 诱导这些参数显着增加。ISO 和 VERA 对缩短面积 (D) 和缩短分数 (E) 产生相反的影响。

(F) (i) 在 MCS 和 MRS 期间，SD 和 mREN 细胞位移速度显示在幅度和矢量场中，具有视觉和数字强度尺度检测。比例尺，20 微米。(ii) 在一个收缩-松弛周期中 SD 和 mREN 细胞的图形比较。(iii)–(iv) SD 和 mREN CM 显示相似的 MCS 和 MRS。(v)–(vi) 与 SD 相比，mREN 细胞的收缩和松弛时间有所增加。对于每个细胞，我们分析了至少 10 个事件（每个事件对应一个收缩-松弛周期），结果代表这些事件的平均值。结果表示为来自每个实验组的平均 30 个细胞的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 与对照相比。

该系统 的另一个特点是可以获取成人 CM 细胞长度的缩短百分比。在 Motion Visualization 的窗口中（Advanced > Export cell length data— Methods S1：User Manual— section 7.4 Figure 70），用户可以打开一个新窗口来测量细胞长度的缩短百分比（图 S3）。该窗口显示波选择框，其中包含先前选择的收缩-松弛波（图 S3 A上的蓝色条，左侧）及其各自的图形（图 S3 A，右侧）。该系统 使用细胞分割过程来获取细胞边界长度并应用过滤器来找到细胞的佳分割（图 S3B). 数据可以可视化并实时绘制图表（图 S3 C）。然后，可以导出分析的波形数据。为了验证我们的分割方法，我们通过使用经异丙肾上腺素和维拉帕米处理或未处理的成人 CM 进行了缩短细胞长度百分比分析。如图 4 E所示，ISO 增加了成人 CM 细胞长度的缩短百分比，而 VERA 减少了它。综上所述，我们的数据表明，该系统 可以可靠、高效地处理和分析来自成人 CM 的数据，检测药物作用下收缩参数的差异。例如，这种敏感性允许研究可能具有心脏保护作用的药物，以及与现有心脏病相关的变化。

该系统 在大鼠高血压模型中的适用性

收缩力缺陷是高血压动物模型的一个共同特征（Jesus 等人，2020 年；Kovács 等人，2016 年）。在这里，我们使用了一种充分表征的高血压大鼠模型，该模型由肾外组织中肾素的基因过度表达引起，即 TGR (mREN2)27 大鼠（Langheinrich，1996 年；Mullins 等人，1990 年）。mREN CM 的一个重要特征是细胞面积增加，这是心肌肥大的特征（Jesus 等人，2020 年）). 鉴于 该系统 获取幅度速度的平均值，比较的单元格之间的大小差异越大，获取可能存在的差异的灵敏度就越低。因此，与 Sprague-Dawley (SD) 大鼠肌细胞相比，测量肥大 mREN 肌细胞的数据时可能会出现问题。为了避免这个问题，我们通过使用新的过滤器（幅度阈值）实现了一个管道（有关详细信息，请参见方法 S1：用户手册—— 7.3 节，幅度阈值过滤器）。

图 4 Fi–ii 显示了带有运动矢量的 CM 图像以及 SD 和 mREN 肌细胞的平均速度轨迹的比较。如图 4 Fiii–iv所示，SD 和 mREN 肌细胞之间的大收缩或舒张速度没有差异。另一方面，与 SD 细胞相比，该系统 检测到 mREN 肌细胞的收缩和舒张时间显着增加（图 4 Fv-vi）。收缩参数详见表S2。这些结果通过更详细地显示通过矢量场的细胞运动以及整个细胞，扩展了先前的发现（ Jesus 等人，2020 年）。

新生儿 CM 培养和 hiPSC-CM 中的 该系统 验证

来自不同发育阶段的心肌细胞显示出功能和结构差异。该系统 旨在获取 CM 在不同成熟和细胞发育阶段的多个实验条件下的收缩参数。hiPSC-CM 和新生儿-CM 是未成熟细胞，与成年心室肌细胞相比表现出明显的形态和结构组织特征（Bedada 等人，2016 年；Khan 等人，2015 年；Li 等人，2017 年；Rohr 等人， 1991). 这种结构上的不成熟会影响 CM 的收缩性，它比成人 CM 的强度要低得多，并对其采集和分析提出了挑战。此外，hiPSC-CM 和新生儿 CM 会自组织成合胞体并表现出自发收缩（Bedada 等人，2016 年；Li 等人，2017 年）。

HiPSC-CM 已通过不同的技术进行探索，以获得收缩和松弛的细胞动力学（Czirok 等人，2017 年；Huebsch 等人，2015 年；Maddah 等人，2015 年；Pointon 等人，2017 年）。然而，它们在研究和临床中心作为常规应用仍然是一个挑战，要么是由于实施困难，要么是因为仍然缺少具有强大处理能力的工具以及为非专业观众设计的界面。该系统 提供了一种可靠、快速且易于访问的方法来处理和分析这些细胞类型的收缩动力学，从图像到终结果集。

使用 该系统，我们确定了 hiPSC-CM（图 5和S4）和新生儿 CM（图 6 ）在基础控制条件下以及与 ISO 和 VERA 孵育后的收缩和松弛周期的平均速度。图 5 A 显示了检测所有 hiPSC-CM 合胞体运动的示例空间图像，它允许用户从多个收缩-松弛周期中提取平均速度轨迹（图 5 B）。为了在单波水平上更好地了解 ISO 和 VERA 治疗，图 5绘制了每个特定波的图表C. ISO 和 VERA 对 hiPSC-CM 的影响也以浓度依赖的方式发生，并且在速度依赖参数（图 S4 A）和平均缩短面积（图 S4 B）上显示出相反的结果，正如我们对这些药物的预期. 正如先前在文献中报道的那样（Hayakawa 等人，2014 年），在使用 ISO 和 VERA 治疗后观察到收缩和舒张时间的相当减少（图 S4 C）。此外，ISO 和 VERA 增加了 hiPSC-CM 的跳动频率（图 S4 D）。总而言之，这些结果证实了我们系统的多功能性，为用户提供了获得视觉和定量评估的可能性通过微妙的修改不同的收缩细胞类型。

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图 5。异丙肾上腺素和维拉帕米在 hiPSC-CM 收缩力中的收缩波运动和图形检测

(A) 从用异丙肾上腺素 (100 nmol L -1 ) 或维拉帕米 (100 nmol L -1 ) 处理的细胞获得的视觉和数值强度标度检测中的 hiPSC-CM 大位移速度。比例尺，50 微米。

(B) 异丙肾上腺素或维拉帕米治疗平均速度的图形检测。

(C) 比较一个收缩-松弛周期中药物引起的变化。MCS，大收缩速度；MRS，大弛豫速度。另请参见图S4。

同样，图 6 A 显示该系统通过膜位移和运动矢量的生成，有效检测 ISO 和 VERA 新生儿 CM 治疗组的细胞收缩力差异（图 6 Ai-iii ）。此外，分析表明，ISO 和 VERA 均以浓度依赖性方式显着减少新生儿 CM 的收缩和松弛时间（图6 B）。正如对这些药物所预期的那样，用 ISO 治疗会导致速度相关参数（图 6 C）和 CM 缩短区域（图 6D)，而 VERA 处理的细胞观察到减少。此外，该系统检测了接受药物治疗或未接受药物治疗的新生儿 CM 的自律。在分析新生儿 CM 的搏动频率时，也观察到 ISO 和 VERA 的相反结果（图 6 E）。hiPSC-CM 和新生儿-CM 在用不同浓度的药物治疗后的收缩参数分别列于表 S3和S4中。

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图 6。异丙肾上腺素和维拉帕米对新生儿 CM 收缩力影响的收缩波运动和图形检测

(A) (i) 在从异丙肾上腺素 (100 nmol L ?1 ) 或维拉帕米 (100 nmol/L ?1 ) 治疗的作用获得的收缩-松弛周期期间，新生儿 CM 细胞在视觉和数值强度尺度检测中的位移速度。比例尺，50 微米。(ii) 从异丙肾上腺素或维拉帕米治疗的新生儿 CM 记录的平均速度修改的图形检测。(iii) 比较一个收缩-松弛周期中药物引起的变化。

(B) 用 ISO 和 VERA 进行急性治疗可显着降低新生儿 CM 的收缩和舒张时间参数。

(C) 用 VERA 处理的细胞表现出 MCS 和 MRS 减少，而 ISO 诱导这些参数显着增加。

(D) 同样，ISO 和 VERA 对缩短区域产生相反的影响。

(E) 两种处理对细胞跳动浓度-反应曲线显示出相反的效果。从每个细胞区域，我们分析了至少 10 个事件（每个事件对应于收缩-松弛周期），结果代表这些事件在 ISO 和 VERA 存在或不存在的情况下的平均值。结果表示为来自每个实验组的 20 个细胞区域的平均值±SE。?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ???p < 0.0001 与对照相比。

为了总结我们的发现，表 S5比较了收缩和松弛速度的大倍数变化，以及用 ISO 或 VERA 处理的成人 CM、新生儿 CM 和 hiPSC-CM 之间的缩短面积参数。如表S5所示，与成人 CM 和新生儿 CM 相比，hiPSC-CM 在收缩和松弛速度大倍数变化方面对 ISO 的响应较弱。这一发现表明，与 hiPSC-CM 相比，新生细胞的 β-肾上腺素能反应有所改善，并表明这两种细胞类型之间的成熟度存在差异。尽管成人 CM 和新生儿 CM 具有相似的大倍数变化值，但前者表现出较低的半数大有效浓度，证实了这些细胞对 ISO 的反应更强。这与以下事实一致：与成人 CM 相比，hiPSC-CM 和新生儿 CM 呈现不成熟的 β-肾上腺素能受体信号（Jung 等人，2016 年；Slotkin 等人，1995 年）). 然而，与成人 CM 相比，新生儿 CM 和 hiPSC-CM 对 VERA 的反应更强，在新生儿细胞中观察到更明显的抑制收缩作用。同样，与成人 CM 相比，新生儿 CM 和 hiPSC-CM 显示 MCS 对 VERA 的半数大抑制浓度降低。这些差异至少部分反映了未成熟细胞对肌膜 Ca 2+循环的高度依赖性和未成熟 Ca 2+释放单元的存在（ Korhonen 等人，2009 年；Louch 等人，2015 年）。总的来说，这些数据增强了我们软件检测细胞对不同药物的收缩反应差异的敏感性。