名称：奶牛乳腺类器官培养基试剂盒

货号：WS001-100-KIT/WS001-500-KIT

规格：100ml/500ml

品牌：WinSera

一、试剂盒组成：

二、使用方法：

1、 原代
（1）取材后的奶牛乳腺组织须在 2-8℃含有组织保存液 E的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，拍照并登记信息。
（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B备用。
（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B清洗三次后，利用眼科剪或手术dao将肿瘤组织jian切成体积约为1-3mm3的组织块。
（4）组织用奶牛乳腺原代组织xiao化液 C消化，37℃震荡消化10-20min，（消化过程中随时观察消化情况）。
（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后，加入三倍体积奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B终止消化。
（6）使用100um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B重新重悬离心。
（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。
（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加奶牛乳腺类器官培养基 A（恢复室温）进行培养。
2、 类器官传代培养
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液 B放置2min。
（2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）a. 类器官数量不足或体积较小时： 离心5min弃去上清，添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
b. 类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液 D消化2-3min，添加奶牛乳腺类器官缓冲液 B终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
（4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500ul奶牛乳腺类器官培养基 A。
3、类器官冻存
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液 B放置2min。
（2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）离心5min弃去上清，添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B再次重悬，300g离心5min弃去液体。
（4）添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积1.4ml。
（5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。
4、 类器官复苏
（1）取10ml奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B于15ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内全部融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300g 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
（5）基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min成胶，添加500ul奶牛乳腺类器官培养基 A。

三、储存/保存方法

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温馨提示：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究