免疫细胞化学3D 生物打印机

概述

免疫细胞化学 （ICC） 是一种实验室技术，允许使用可在显微镜下可视化的选择性探针检测细胞中的特定蛋白质或抗原。该方案描述了使用针对特定靶标的一抗和用荧光探针标记的二抗的两步ICC。以下方案针对由封装在水凝胶中的细胞组成的3D生物打印样品进行了调整。

材料

• PBS

• PBS/0.1% Triton-X 溶液

• PBS/0.1% Triton-X/1% 牛血清白蛋白 （BSA）

• 10% 福尔马林或 4% 多聚甲醛 （PFA）

• DAPI解决方案

• 封固剂

• 硅脂

• 显微镜载玻片

• 盖玻片

方法

1. 小心地从样品中吸出培养基;

2. 在 PBS x3 中洗涤 1D 生物打印结构 5 分钟。确保整个结构浸入 PBS 中;

3. 在室温下用 10% 福尔马林或 4% PFA 固定 30 分钟，将构建体浸入固定剂中;

4. 在室温下用PBS/3.0%Triton-X/1%洗涤1次15分钟，以透化细胞膜;

5. 将一抗在 PBS/0.1% Triton-X/1% BSA 中稀释至终浓度的样品在 4°C 下孵育过夜;

6. 在 PBS/3.15% Triton-X 中洗涤 0 次 1 分钟;

7. 将样品与在PBS/0.1%Triton-X/1%BSA中稀释的二抗在室温下避光孵育2h;

8. 在室温下在PBS中洗涤3次15分钟;

9. 在PBS中将DAPI稀释至终浓度为0.1μg/ ml至10μg/ ml，并将3D生物打印结构浸入所得溶液中。在避光室温下孵育 15 分钟;

10. 在室温下在PBS中洗涤3次15分钟;

11. 拿一个显微镜载玻片，手动挤出一些硅脂油脂，形成一个比你的3D结构略大的孔（载玻片处理方案);

12. 将您的 3D 生物打印结构移动到显微镜载玻片上的硅胶上;

13. 将封固剂加入硅胶孔中，直至填充;

14. 将盖玻片放在上面并轻轻按压。硅脂不会是固体，因此请小心执行此步骤;

15. 使用选定的方法进行成像。我们建议对 3D 样品进行共聚焦荧光成像或双光子显微镜。切记将薄盖玻片靠近显微镜物镜，以获得更好的成像效果;

警告

根据构建体的厚度、生物材料渗透性和几何形状，可能需要增加 ICC 方案的孵育时间。每个孵育时间都可以在振荡器或轨道振荡器上进行，以帮助溶液的扩散。

只有当所使用的生物材料不透明并且可以被显微镜使用的光穿透时，成像才能正常工作。一些生物材料可能会显示自发荧光并干扰成像 - 如果出现此问题，请尝试选择合适的滤光片。

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