一、实验目的： 掌握PCR反应的基本原理与实验技术

二、PCR反应实验原理
   PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA。
   上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增10⁶～10⁹倍。
    典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTPs、MgCl₂、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
三、 试剂和缓冲液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
四、 仪器耗材
PCR仪，掌上离心机，微量移液器，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒。
五、 实验步骤（每人一组，每人做1管，纯化时两人一组）
1. 查找基因序列，设计合成PCR引物。注意合成引物约需一周时间，请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μL反应体系中，加入：
　　　　模板DNA (5ng/μL)        1   
　　　　引物P₁P₂ (10μmol/L)    各1   
　　　　2×PCR mix              25 
　　　　ddH₂O                  22 
在冰上配制，注意混匀后离心。加入10μL石蜡油覆盖。
3. 在PCR仪中预变性94℃ 4min，然后循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；循环结束后，72℃10min 。扩增的PCR产物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR产物2-5μL与上样缓冲液混合，点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳，160V 30-40min。
　　6. 电泳结束，溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. PCR产物切胶回收。步骤参见胶回收Kit说明书。
A 酶切片段的纯化及其回收
使用切胶回收kit进行PCR产物的回收。具体操作步骤如下，详见说明书。
1）称回收的胶，每0.1g加100µL XP2 ；
2）55度5-7分钟至溶胶 ；
3）取溶胶液加入回收柱子，最大体积700µL；10000g, 1min；
4) 加300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加700µl SPW ，10000g 1min；
6）重复5）；
7）空管离心2min，13000 g
8）干燥，加15-30µL  Eulation Buffer
9）13000 g，1min
 
DNA产物纯化kit，操作步骤：

• 将PCR反应液（40ul）或酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的buffer3，充分混匀。（用前确定加入适量的异丙醇）

• 将混合液全部移入吸附柱，8000g离心30s；将滤出液再次加入到吸附柱中再次过柱，8000g离心30s（此步骤可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

• 向吸附柱中加入500ul Wash Solution（加到壁上），9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。（Wash Solution使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇）

• 重复步骤3一次

• 将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。下管扔掉，上管放入1.5ml离心管中，晾干。（残余的乙醇会严重影响得率和后续试验）

• 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前预热（进一步提高得率）的Elution Buffer（加到滤芯上），室温静置1min，9000g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

注意：本步骤中，所有转速单位为g。

B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法对PCR产物回收。具体操作步骤如下。

• 加入等体积的冰无水乙醇，加入1/10体积的KAc（3M  pH5.2）。

• 上下颠倒混匀，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。

• 弃上清，加入70%的冰乙醇，轻轻混匀。12000r/min 4℃离心10min。

• 弃上清，室温干燥，至无乙醇。

• 加入适量体积的ddH2O。

六、注意事项

1. 进行PCR反应时，注意加入试剂的顺序。注意加入任何一种试剂后均需混匀。
2. 本实验使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀释：分子量24bp*324.5 = 7788，质量数10OD*33 ＝33ug，摩尔数=33/7788 =4.2 nmol，母液浓度4.2 n mol / 84μL H₂O = 50μmol/L，使用时取母液稀释5倍，则终浓度为10μmol/L。
4. PCR扩增产物共20μL，其中2-5 μL用于检测，剩余的用于纯化回收。
5. 使用自己的实验材料进行PCR扩增的学生，请提前准备引物和模板。

 

附1：基因序列查找和PCR引物设计

实验课进行之前，需要利用NCBI查找基因序列，并设计PCR引物。

• 进入NCBI（后，在Search的下拉框中选择Nucleotide，再输入基因名称，点击Search即可。也可输入具体的物种名以缩小范围，获得cDNA 序列信息。

例如：水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（Oryzacystatin, OC）序列信息
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA

• 引物设计。要求扩增上述完整的cDNA 序列，并在两端添加酶切位点，5‘添加EcoRI（GAATTC）， 3‘端添加HindIII （AAGCTT）。以便克隆到pET30a的相应位点。

注意PCR产物中没有上述酶切位点，否则不能使用。
prim-OC2-R   GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC    26bp  下划线为EcoRI识别序列
#prim-OC2-F   GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC    26bp  下划线为HindIII 识别序列
 
T载体通用引物
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA