质粒DNA的提取实验方法和步骤

一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤。
二、实验原理
从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞：分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100 可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100 处理后，细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA 比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
三、主要试剂
1． 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris (pH 8.0) ，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）
2． 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS（新鲜配制）
3． 溶液Ⅲ：5 mol/L乙酸钾 60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL
4. 70%乙醇
5. 氯仿: 按氯仿:异戊醇＝24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。氯仿均有很强的腐蚀性。
6. RNaseA：将RNA酶溶于10 mmol/L Tris. (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
7. LB+Amp100培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。
四、仪器耗材
恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。
五、实验步骤
1. 从平板上挑取单克隆，加入含有3mL LB+Amp100的试管中，37℃振荡培养过夜。
2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。
注：剩余培养物放置4℃，用于保菌。
3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100 μL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5 min。
5. 加200 μL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上5 min 。
6. 加入150 μL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min。
7. 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。350μL
8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。该步骤可以不做。
9. 向上清加入2倍体积乙醇700μL，混匀后，室温放置15-30min。10000r/min离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10. 用500 μL 70% 乙醇轻轻洗涤质粒DNA沉淀，离心10000r/min离心5min弃上清，干燥。
11. 加入适量（20-50 μL）的无菌水，室温使DNA溶解，-20℃保存。
六、注意事项
1. 溶液II需要新鲜配制。
2. 加入溶液II后不能剧烈震荡。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
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