一、耐热大肠菌群情况简要介绍

  耐热大肠菌群的定义：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。

  通常情况下，耐热大肠菌群与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。

二、参考标准

  《GBT5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标：耐热大肠菌群》 点击下载

三、检验方法以及结果分析

  3.1多管发酵法

  根据耐热大肠菌群具有的生物特性，在44.5℃培养24 h能发酵乳糖并产气的特点，将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中，经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中耐热大肠菌群的最可能数（MPN）。

  3.1.1 检验步骤

  3.1.1.1 乳糖发酵试验

  （1）取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。

  对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。

  检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1、0.1、0.01mL甚至0.1、0.01、0.001mL，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。

  （2）将接种管置36℃±1℃培养箱内，培养24 h±2 h。

图1 耐热大肠菌群在乳糖蛋白胨培养液中生长特征

  （3）从阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中，置44.5℃水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24h±2h，如所有管均不产气，则可报告为阴性。

图2 耐热大肠菌群在EC培养基中生长特征

  如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5℃培养18 h～24 h观察菌落形态。凡平板上有以下典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性：

  深紫黑色、具有金属光泽的菌落；

  紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；

  淡紫红色、中心较深的菌落。

图3 耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基中生长特征

  （4）如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按照步骤（1）接种乳糖蛋白胨培养液在44.5℃±0.5℃水浴中培养，以下步骤同步骤（3）。

  3.1.2 结果报告

  根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查本标准中总大肠菌群最可能数（MPN）检索表，报告每100 mL水样中耐热大肠菌群的最可能数（MPN）值。

表1 耐热大肠菌群（MPN）检索表（部分）

（总接种量55.5mL，其中5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样）

  3.2滤膜法

  耐热大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45μm的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在加乳糖的选择性培养基上，44.5℃培养24h能形成特征性菌落以此来检测水中耐热大肠菌群的方法。

  3.2.1 检验步骤

  （1）准备工作

  滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。

  滤器灭菌：用点燃的酒精棉球火焰灭菌。也可用蒸汽灭菌器103.43kPa（121℃）高压灭菌20min。

  （2）过滤水样

  用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07×10⁴Pa（负0.5大气压）下抽滤。

  （3）培养

  水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基wan全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24h±2h。如使用恒温水浴，则需用塑料平皿，将皿盖紧，或用防水胶带贴封每个平皿，将培养皿成叠封入塑料袋内，浸到44.5℃恒温水浴里，培养24h±2h。耐热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色，非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色。

图4 耐热大肠菌群在MFC培养基上的菌落特征

  （4）对可疑菌落转种EC培养基，44.5℃培养24h±2h，如产气则证实为耐热大肠菌群。

  3.2.2 结果报告

  计数被证实的耐热大肠菌落数，水中耐热大肠菌群数系以100mL水样中耐热大肠菌群菌落形成单位（CFU）表示，见下列公式：

  耐热大肠菌菌落数（CFU/100mL）=所计得的耐热大肠菌菌落数×100过滤水样体积 

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