原代细胞分离

　　一、细胞培养

　　1.取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的初次培养称为原代培养。

　　2.培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。3冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以的冷却速度冻存，终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

　　二、原代细胞分离

　　凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。1悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。2实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。

　　三、细胞增殖检测技术

　　目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cellviability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以直接的证据应该采用方法一。

　　其中常见检测：CCK8检测法，MTT检测法，Brdu检测法，Edu检测法，平板克隆形成。

　　四、细胞周期检测技术

　　细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。

　　常用的方法：流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法。

　　五、细胞凋亡检测

　　常见检测方法：流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色，电镜，TUNEL。

　　六、细胞转移能力检测

　　常见检测方法：细胞划痕实验，Transwell实验，Invasion实验

　　七、其他实验

　　细胞恶性程度：软琼脂实验

　　细胞屏障：跨膜电阻、荧光黄透过率、细胞粘附实验、共培养实验、裸鼠成瘤实验。